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Articles by Ilana Nissim in JoVE
JoVE General
Stable profilage isotopique du flux métabolique intermédiaire dans la phase de développement et de l'adulte Caenorhabditis elegans
1Department of Pediatrics, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania
Stable profilage isotopique par analyse spectrométrique de masse chromatographie en phase gazeuse du flux métabolique intermédiaire est décrite dans le nématode,
Other articles by Ilana Nissim on PubMed
Règlement De La Synthèse De L'urée Par Agmatine Dans Le Foie Perfusé: études Avec 15N
L'administration de l'arginine ou un régime riche en protéines augmente la teneur en N-hépatique de acétylglutamate (NAG) et la synthèse de l'urée. Cependant, le mécanisme sous-jacent est inconnu. Nous avons exploré l'hypothèse selon laquelle l'agmatine, un métabolite de l'arginine, peut stimuler la synthèse de NAG et, par conséquent, synthèse de l'urée. Nous avons testé cette hypothèse dans un système de perfusion du foie afin de déterminer 1) le métabolisme de la L-[guanidino-15N2] arginine soit agmatine, l'oxyde nitrique (NO), et / ou de l'urée; captation hépatique 2) de perfusat agmatine et son action sur N hépatique du métabolisme et 3) le rôle de l'arginine, l'agmatine, ou NO dans la régulation de la synthèse NAG et dans le foie perfusé ureagenesis avec de la glutamine 15N et de l'ammoniac non ou glutamine 15NH4Cl et non marqué. Nos principales conclusions sont: 1) [guanidino-15N2] agmatine est formée dans le foie à partir de perfusat L-[guanidino-15N2] arginine (environ 90% de l'agmatine hépatique est dérivé de l'arginine perfusat), 2) des perfusions avec agmatine considérablement stimulé la synthèse de 15N NAG et [15N] urée à partir de 15N-étiquetés d'ammoniac ou de la glutamine et 3) les niveaux accrus de agmatine hépatique sont fortement corrélés avec des niveaux accrus de synthèse et de 15N NAG et [15N] urée. Ces données suggèrent une stratégie thérapeutique possible y compris l'utilisation de l'agmatine pour le traitement de ureagenesis dérangé, que ce soit secondaire à des erreurs innées du métabolisme ou à une maladie du foie.
Règlement De La Leucine-sécrétion D'insuline Stimulée Et Métabolisme De La Glutamine Dans Les îlots De Rats Isolés
Glutamate déshydrogénase (GDH) est réglementée par les deux positifs (la leucine et de l'ADP) et négatifs (GTP et d'ATP) facteurs allostériques. Nous émettons l'hypothèse que le potentiel phosphate de bêta-cellules régule la sensibilité de la stimulation leucine. Ces prédictions ont été testées par la mesure de la leucine-sécrétion d'insuline stimulée dans les îlots de rat perifused suivants la consommation de glucose et en traçant les flux d'azote de [2 - (15) N] glutamine en utilisant des techniques d'isotopes stables. La sensibilité de la stimulation a été renforcée par la leucine longtemps (120-min) déplétion énergétique et inhibée par un prétraitement de glucose. Après l'épuisement du glucose limitée de 50 minutes, la leucine, pas alpha-cétoisocaproate, pas réussi à stimuler la libération d'insuline. les bêta-cellules de sensibilité à la leucine est donc proposé d'être une fonction d'activation GDH. Leucine augmenté le flux à travers la GDH à 3 fois par rapport aux témoins tout en provoquant la libération d'insuline. Taux élevé de glucose inhibe le flux à travers à la fois glutaminase et GDH, et la leucine a été incapable de passer outre cette inhibition. Ces résultats montrent clairement que la leucine induit la sécrétion de l'insuline en augmentant glutaminolysis travers glutaminase l'activation et la GDH. Glucose régule la sensibilité des cellules bêta en leucine en élevant le rapport de l'ATP et GTP à l'ADP et P (i) et en diminuant ainsi le flux à travers GDH et glutaminase. Ces mécanismes fournissent une explication de l'hypoglycémie provoquée par des mutations de GDH chez les enfants.
Le Métabolisme De Cerveau Acides Aminés Suivant Le Traitement Pentylènetétrazole
Nous avons étudié les effets de pentylènetétrazole (PTZ) sur le métabolisme des acides aminés du cerveau chez la souris. L'administration de ce convulsivant n'a pas changé les concentrations d'acides aminés du cerveau antérieur, mais quand les animaux traités a également reçu une injection de [15N] leucine, qui a servi en tant que traceur du métabolisme azoté du cerveau, au total (15 14N N) prosencéphale [leucine] de contrôle dépassé et [glutamate] et [aspartate] étaient moins que le contrôle, ainsi que les concentrations du cerveau antérieur de [15N] glutamate et [2-15N] glutamine. Ces données suggèrent une plus grande absorption de [15N] transamination leucine, mais la diminution de la leucine au glutamate chez les souris expérimentales. En revanche les études [15N] leucine, qui ont été associés à une augmentation du cerveau [leucine], l'administration de [15N] alanine ne modifie pas les niveaux d'alanine, le glutamate ou la glutamine. Toutefois, l'étiquette est apparu dans [2-15N] glutamine beaucoup plus facilement avec [15N] alanine qu'avec [15N] leucine en tant que précurseur et le rapport de l'enrichissement en [2-15N] glutamine / [15N] alanine était beaucoup plus élevé que dans [2-15N] glutamine / [15N] leucine, une conclusion qui est compatible avec le métabolisme préférentiel de l'alanine dans les astrocytes, qui sont le site primaire de la glutamine synthétase du cerveau. Nous concluons que le traitement PTZ favorise l'absorption de certains acides aminés comme la leucine, mais diminue aussi la transamination de la leucine pour donner du glutamate par l'intermédiaire à chaîne ramifiée transaminase d'acide aminé. Traitement PTZ peut favoriser la "inverse" transamination d'acide 2-céto-isocaproate (CCI), l'cétoacide de la leucine, la leucine et pour former à consommer du glutamate. Un résultat net de ces processus peut être de permettre au cerveau plus facilement se débarrasser du glutamate qui est libérée par les neurones pendant l'activité convulsive.
Rôle De La Réaction De Glutamate Déshydrogénase En Azote Aspartate Ameublement Pour La Synthèse De L'urée: études Dans Le Foie De Rat Perfusé Avec 15N
La présente étude visait à déterminer: (i) le rôle de l'amination réductrice de l'alpha-cétoglutarate via la réaction de la glutamate déshydrogénase de glutamate mitochondrial et son ameublement transamination en aspartate; (ii) l'incorporation relative de perfusat 15NH4Cl, [2-15N ] glutamine ou [5-15N] glutamine en phosphate et de l'aspartate-carbamoyle N et, de ce fait, des [15N] isotopomères urée, et (iii) la mesure dans laquelle perfusat [15N] aspartate est repris par le foie et incorporé dans [15N ] urée. On a utilisé un système de perfusion du foie-physiologique contenant un mélange d'acides aminés et d'ammoniac à des concentrations similaires in vivo, avec une étiquette 15N que dans la glutamine, l'ammoniac ou l'aspartate. Les résultats démontrent que dans les perfusions avec un mélange physiologique des acides aminés, env. 45 et 30% du total d'urée-N sortie a été dérivé de l'ammoniac liquide de perfusion et de la glutamine-N, respectivement. Environ les deux tiers de l'ammoniac utilisé pour la synthèse phosphate de carbamoyle est dérivé de l'ammoniac liquide de perfusion et un tiers de la glutamine. Perfusat [2-15N] glutamine, [5-15N] glutamine ou [15N] aspartate fourni 24, 10 et 10% respectivement de l'aspartate-hépatique N piscine, tandis perfusat 15NH4Cl fourni environ. 37% de l'aspartate-N utilisée pour la synthèse d'urée, secondaire à la formation de filet [15N] par la réaction du glutamate déshydrogénase de glutamate. Les résultats suggèrent que le glutamate mitochondrial formé par l'amination réductrice de l'alpha-cétoglutarate peut avoir un rôle clé dans la détoxication d'ammoniac par les processus suivants: (i) la fourniture d'aspartate-N pour ureagenesis; (ii) servir de trésor pour un excès d'ammoniac; et (iii) l'amélioration de la disponibilité de la mitochondrie [glutamate] pour la synthèse de la N-acétylglutamate. En outre, les résultats actuels suggèrent que la formation de l'aspartate par la réaction de l'aspartate aminotransférase mitochondriale peut jouer un rôle important dans la synthèse de argininosuccinate cytosolique.
Un Rôle De Signal De La Glutamine Dans La Sécrétion D'insuline
Enfants ayant hypoglycémie due à la perte de fonction de mutations récessif de la bêta-cellule sensible à l'ATP de potassium (K (ATP)) de canal peut développer une hypoglycémie, en réponse à l'alimentation protéine. Nous émettons l'hypothèse que les acides aminés pourrait stimuler la sécrétion d'insuline par des mécanismes inconnus, parce que le K (ATP) canal-dépendante voie de sécrétion d'insuline est défectueux. Nous avons donc étudié les effets des acides aminés sur la sécrétion d'insuline et de calcium intracellulaire dans les îlots de récepteur normal et une sulfonylurée 1 KO (SUR1-/ -) chez la souris. Même si SUR1-/ - souris sont euglycémique, leurs îlots sont considérés comme un modèle approprié pour les études du défaut génétique humain. SUR1-/ - îlots, mais pas îlots normales, libérée d'insuline en réponse à une rampe de mélange d'acides aminés. Cette réponse aux acides aminés a été diminué de 60% lorsque la glutamine a été omise. La libération d'insuline par SUR1-/ - îlots a également été stimulée par une rampe de la glutamine seule. La glutamine est plus puissant que le glutamate de diméthyle ou la leucine. Basale du calcium intracellulaire a été élevée dans SUR1-/ - îlots et a encore augmenté par la glutamine. Dans les îlots normales, sulfoximine de méthionine, un inhibiteur de glutamine synthétase, la libération d'insuline supprimées en réponse à une rampe de glucose. Cette inhibition a été inversée par la glutamine ou de 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, un analogue non métabolisable glutamine. Glucose à haute doublé les niveaux de glutamine d'îlots. Inhibition de la méthionine sulfoximine la sécrétion d'insuline glucose stimulé a été associé à l'accumulation de glutamate et d'aspartate. Nous émettons l'hypothèse que la glutamine joue un rôle essentiel en tant que molécule de signalisation dans des acides aminés et du glucose stimulée par la sécrétion d'insuline, et que la dépolarisation des cellules bêta et après l'élévation du calcium intracellulaire sont nécessaires pour cet effet de la glutamine pour se produire.
Régime Cétogène, Métabolisme Du Glutamate Du Cerveau Et Le Contrôle Des Crises
Nous ne savons pas le mode d'action de la diète cétogène dans le contrôle de l'épilepsie. Une possibilité est que la manipulation du cerveau altère alimentation du glutamate, le neurotransmetteur excitateur majeur et un facteur probable en évoquant et de perpétuer une convulsion. Nous avons constaté que le métabolisme du cerveau de corps cétoniques peut fournir jusqu'à 30% de carbone glutamate et la glutamine. Le métabolisme du corps cétone fournit également l'acétyl-CoA synthétase à la réaction de citrate, de l'oxaloacétate processus long et diminuant ainsi la transamination du glutamate à l'aspartate, une voie dans laquelle oxaloacétate est un réactif. Glutamate relativement plus est alors disponible pour la réaction de glutamate décarboxylase, ce qui augmente le cerveau [GABA]. La cétose augmente également le cerveau [GABA] en augmentant le métabolisme du cerveau d'acétate, qui glie convertir en glutamine. Neurones GABA-ergiques facilement absorber l'acide aminé-ci et l'utiliser comme un précurseur de GABA. La cétose peut aussi être associée au transport d'acides aminés altérée à la barrière hémato-encéphalique. Plus précisément, la cétose peut favoriser la libération à partir du cerveau de la glutamine, qui transporteurs à l'échange barrière hémato-encéphalique pour la leucine sang. Depuis la glutamine cerveau est formé dans les astrocytes de glutamate, l'effet global sera de favoriser la libération de glutamate par le système nerveux.
La Biosynthèse Des Agmatine Dans Le Foie De Rat Isolé Et Perfusé Mitochondries: études Avec 15N Arginine
Une question importante non résolue est de savoir si, mais les mitochondries de mammifères métaboliser l'arginine pour agmatine par l'ADC (arginine décarboxylase) réaction. 15N arginine a été utilisé comme un précurseur de répondre à cette question et de déterminer le flux à travers la réaction ADC dans les mitochondries isolées de foie de rat obtenu. En outre, le système de perfusion du foie a été utilisée pour examiner une éventuelle action de l'insuline, le glucagon ou d'AMPc sur un flux à travers la réaction ADC. En perfusion mitochondries et le foie, 15N agmatine a été généré à partir externe 15N arginine. La production de 15N agmatine était temps-et dose-dépendante. Le temps-cours de [U-15N4] agmatine formation à partir de 2 mM [U-15N4] arginine a été mieux adaptée à une courbe d'un phase exponentielle avec un taux de production d'env. 29 x pmol min (-1) x (mg de protéine) (-1). Les expériences avec une concentration croissante (0 - 40 mm) de [guanidino-15N2] arginine a montré une constante de Michaelis km pour l'arginine de 46 mM et une Vmax de 3,7 min x nmol (-1) x (mg de protéine) (-1) pour le flux à travers la réaction ADC. Des expériences avec des mitochondries cassé a montré peu de changements dans Vmax ou valeurs de Km, ce qui suggère que l'absorption d'arginine mitochondrial eu peu d'effet sur la observée Vmax ou valeurs de Km. Les expériences avec la perfusion du foie a démontré que plus de 95% de l'agmatine effluents a été dérivée à partir de perfusat arginine [guanidino-15N2] quelle que soit la condition expérimentale. Cependant, la sortie de 15N agmatine (nmol x min (-1) xg (-1)) a augmenté d'env. 2 fois (P <0,05) dans les perfusions avec l'AMPc. Les conclusions de la présente étude fournissent des preuves convaincantes que les mitochondries ADC est présent dans le foie de rat, et de suggérer que l'AMPc peut stimuler le flux à travers cette voie.
Le Rôle De La Mitochondrie Arginase Bound Dans Le Règlement De La Synthèse De L'urée: études Avec [U-15N4] Arginine, Isolé Mitochondries Hépatiques Du Rat, Et Perfusé
L'objectif principal de cette étude était d'élucider le rôle du métabolisme mitochondrial arginine dans la régulation de la N-acétylglutamate et synthèse de l'urée. Nous émettons l'hypothèse que le catabolisme arginine via la mitochondrie liée ureagenesis augmente arginase en fournissant ornithine pour la synthèse nette de la citrulline, glutamate, N-acétylglutamate, et de l'aspartate. [U-(15) N (4)] arginine a été utilisé comme précurseur et isolé perfusion mitochondries ou le foie comme un système modèle pour surveiller le catabolisme l'arginine et l'incorporation de (15) N dans divers métabolites intermédiaires du cycle de l'urée. Les résultats indiquent qu'environ 8% de l'activité arginase totale mitochondrial est situé dans la matrice, et 90% se trouve dans la membrane externe. Expériences avec mitochondries isolé a montré que environ 60-70% de externe [U (15) N (4)] arginine catabolisme a été récupéré (15) N-marqué ornithine, le glutamate, la N-acétylglutamate, la citrulline, et l'aspartate. La production de (15) métabolites N-étiquetés était temps-et dose-dépendante. Pendant la perfusion du foie, de l'urée contenant une (U (m 1)) ou deux (U (m 2)) (15) a été généré à partir N perfusat [U (15) N (4)] arginine. La sortie de U (m 2) est compris entre 3 et 8% au total d'urée, conforme à la proportion de l'activité de la matrice arginase. U (m 1) a été formée après la production de mitochondriale [(15) N] glutamate de [alpha, delta-(15) N (2)] ornithine et transamination de [(15) N] glutamate de [(15) N ] aspartate. Ce dernier est transporté au cytosol et incorporées dans argininosuccinate. Environ 70, 75, 7, et 5% de l'ornithine hépatique, la citrulline, la N-acétylglutamate, et de l'aspartate, respectivement, ont été dérivés à partir perfusat [U (15) N (4)] arginine. Les résultats confirment l'hypothèse selon laquelle l'arginase intramitochondriale, probablement l'isoenzyme arginase-II, peuvent jouer un rôle important dans la régulation de ureagenesis hépatique par l'ornithine ameublement pour la synthèse nette de N-acétylglutamate, la citrulline, et de l'aspartate.
Réponse Du Métabolisme Des Acides Aminés Du Cerveau à La Cétose
Notre objectif était d'étudier le métabolisme des acides aminés du cerveau en réponse à la cétose. L'hypothèse sous-jacente est que la cétose est associée à un changement fondamental de manipulation de l'acide aminé le cerveau et que cette altération est un facteur de l'effet anti-épileptique de la diète cétogène. Plus précisément, nous faisons l'hypothèse que le cerveau convertit des corps cétoniques à l'acétyl-CoA et que cela résulte en flux accru grâce à la réaction citrate synthétase. En conséquence, l'oxaloacétate est consommée et est moins disponible pour la réaction d'aspartate aminotransférase, par conséquent, moins de glutamate est converti à l'aspartate et le glutamate devient relativement plus à la disposition de la glutamine synthétase et glutamate décarboxylase réactions. Nous avons trouvé dans un modèle murin de la cétose que la concentration du prosencéphale aspartate a été diminué, mais la concentration de l'acétyl-CoA a été augmenté. Les études de l'incorporation de 13C en glutamate et la glutamine soit avec [1 - (13) C] glucose ou [2 - (13) C] acétate comme précurseur a montré que le cerveau cétose métabolisé glucose relativement moins et de l'acétate relativement plus. Lorsque les souris cétosique ont été administré à la fois de l'acétate et un donneur d'azote, tels que l'alanine ou la leucine, ils manifeste une concentration accrue du cerveau antérieur de la glutamine et GABA. Ces résultats soutiennent l'hypothèse que, dans la cétose il ya une plus grande production de l'acétyl-CoA et une altération conséquente de l'équilibre de la réaction d'aspartate aminotransférase que les résultats de la production diminuée aspartate et de synthèse potentiellement accrue de la glutamine et de GABA.
Exigences Du Cerveau D'acides Aminés Et Toxicité: L'exemple De La Leucine
L'acide glutamique est un neurotransmetteur important excitateur du cerveau. Deux objectifs clés de la manipulation du cerveau d'acides aminés sont de maintenir une concentration très faible intrasynaptic de l'acide glutamique et aussi pour fournir le système avec des précurseurs à partir de laquelle faire la synthèse du glutamate. Le niveau de glutamate intrasynaptic doit être maintenu assez bas pour maximiser le rapport signal-bruit sur la libération de glutamate par les terminaisons nerveuses et de minimiser le risque d'excitotoxicité glutamatergique par conséquent à une stimulation excessive des neurones sensibles. Le cerveau doit également fournir les neurones avec un approvisionnement constant de glutamate, dont les deux neurones et cellules gliales robuste s'oxyder. Les acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA), en particulier la leucine, jouent un rôle important à cet égard. Leucine pénètre dans le cerveau du sang plus rapidement que n'importe quel autre acide aminé. Astrocytes, qui sont en rapprochement étroit avec le cerveau capillaires, sont probablement le site initial du métabolisme de la leucine. Un mitochondriale à chaîne ramifiée aminotransférase est très active dans ces cellules. Effet, de 30 à 50% de tous les groupes alpha-amino de glutamate cerveau et de la glutamine sont dérivés de la leucine seule. Astrocytes libérer le cétoacide apparenté [alpha-cétoisocaproate (CCI)] à des neurones qui ont une cytosolique à chaîne ramifiée transaminase que reaminates la CCI à la leucine, de l'glutamate processus long et fournissant un mécanisme pour la "mise en mémoire tampon" du glutamate si les concentrations se excessive. Dans la maladie du sirop d'érable, ou d'une déficience congénitale de déshydrogénase à chaîne ramifiée cétoacide, la concentration dans le cerveau de la CCI et d'autres corps cétoniques à chaîne ramifiée peut augmenter de 10 - à 20 fois. Cela conduit à un appauvrissement de glutamate et une réduction conséquente de la concentration du cerveau glutamine, aspartate, alanine, et d'autres acides aminés. Le résultat est un compromis du métabolisme énergétique raison d'une défaillance de la navette malate-aspartate et un taux diminué de la synthèse protéique.
Agmatine Stimule L'oxydation Des Acides Gras Hépatiques: Un Mécanisme Possible Pour Up-régulation De Ureagenesis
On a démontré précédemment dans un système de perfusion du foie que l'agmatine consommation d'oxygène augmente ainsi que la synthèse du N-acétylglutamate et de l'urée par un mécanisme non défini. Dans cette étude, notre objectif était d'identifier le mécanisme (s) par laquelle l'agmatine jusqu'à régule ureagenesis. Nous émettons l'hypothèse que la consommation accrue d'oxygène et de la N-acétylglutamate et synthèse de l'urée sont couplés à la stimulation induite par l'agmatine de l'oxydation mitochondriale des acides gras. On utilise 13C-marqué d'acide gras en tant que marqueur dans soit un système de perfusion du foie ou pour surveiller les mitochondries, isolé oxydation des acides gras et l'incorporation de 13C-marqué acétyl-CoA dans les corps cétoniques, les intermédiaires du cycle de l'acide tricarboxyliques, d'acides aminés, et la N-acétylglutamate . Avec [U-13C16] palmitate dans le perfusat, agmatine augmenté de façon significative la production de 13C-étiqueté bêta-hydroxybutyrate, acétoacétate, et le CO2, ce qui indique stimulé l'oxydation des acides gras. La stimulation de [U-13C16] oxydation du palmitate a été accompagnée par une plus grande production d'urée et une plus grande enrichissement 13C en glutamate, N-acétylglutamate, et de l'aspartate. Ces observations suggèrent que l'agmatine conduit à l'incorporation accrue et flux de 13C-marqué l'acétyl-CoA dans le cycle de Krebs et à l'utilisation accrue de la 13C-marqué l'acétyl-CoA pour la synthèse de la N-acétylglutamate. Des expériences avec de l'acide mitochondries et marqué au 13C octanoïque isolé a également démontré que l'agmatine synthèse accrue de 13C-étiqueté bêta-hydroxybutyrate, acétoacétate, et N-acétylglutamate. Le document de données courant qui stimule l'agmatine mitochondriale bêta-oxydation et de proposer un accouplement entre la stimulation de la bêta-hépatique oxydation et la régulation positive de ureagenesis. Cette action de l'agmatine peut être médiée par un second messager AMPc tels que, et les effets sur ureagenesis et oxydation des acides gras peuvent se produire simultanément et / ou indépendamment.
À Court Terme à Jeun, Le Contrôle Des Crises Et Métabolisme Des Acides Aminés Du Cerveau
Le régime cétogène est un traitement efficace pour les crises, mais le mécanisme d'action est inconnu. Il n'est pas certain que l'effet anti-épileptique suppose la cétose, ou si la restriction de calories et / ou d'hydrates de carbone pourrait être suffisant. Nous avons constaté que une durée relativement brève (24 h) période de faible taux de glucose et de l'apport calorique faible significativement atténué la gravité des crises chez le jeune rats Sprague-Dawley (50-70 g) dans lesquels des convulsions ont été induites par l'administration de pentylènetétrazole (PTZ). La concentration en glucose sanguin était inférieur chez les animaux qui ont reçu du glucose alimentaire moins, mais le niveau de glucose du cerveau ne diffère pas de sang de contrôle [3-OH-butyrate] ont tendance à être plus élevé dans le sang, mais pas dans le cerveau, des animaux sur une faible glucose d'admission. La concentration dans le cerveau de la glutamine a augmenté et celle de l'alanine diminué de façon significative avec une faible consommation de glucose-. Le niveau de l'alanine sang a chuté de plus que celle du cerveau alanine, ce qui entraîne une augmentation marquée (environ 50%) dans le cerveau: rapport sang pour l'alanine. En revanche, le cerveau: rapport sang pour la leucine a diminué d'environ 35% dans le groupe à faible glucose. Lorsque les animaux ont reçu [1 - (13) C] glucose, un précurseur métabolique de l'alanine, l'apparition de (13) C de l'alanine et la glutamine a augmenté de manière significative par rapport à contrôler. Le cerveau: rapport sang pour [(13) C] alanine dépassé 1, ce qui indique que l'alanine doit avoir été formé dans le cerveau et pas transporté dans le sang. Le cerveau élevée (alanine): le sang (alanine) pourrait signifier qu'une composante de l'effet anti-épileptique de l'apport faible en glucides est la libération de l'alanine à partir du cerveau à sang, dans le processus de complicité la disposition du glutamate, des niveaux excessifs qui dans la fente synaptique serait de contribuer au développement des crises.
Effets D'une Mutation GTP Insensible à La Casse De La Glutamate Déshydrogénase Sur La Sécrétion D'insuline Chez Des Souris Transgéniques
Glutamate déshydrogénase (GDH) joue un rôle important dans la sécrétion d'insuline, comme en témoignent les enfants par le gain de mutations de la fonction de cette enzyme qui causent un syndrome hyperinsulinisme-hyperammoniémie (GDH-HI) et de sensibiliser les cellules bêta à la stimulation leucine. GDH souris transgéniques ont été générées pour exprimer la mutation H454Y humaine GDH-HI et humaine de type sauvage dans les îlots GDH entraînés par le promoteur de l'insuline du rat. H454Y expression du transgène a été confirmée par l'activité enzymatique accrue GDH dans les îlots et une diminution de la sensibilité à l'inhibition de GTP. Les H454Y GDH souris transgéniques avaient une hypoglycémie avec des taux de croissance normales. H454Y GDH îlots transgéniques sont plus sensibles à la leucine et la sécrétion d'insuline stimulée par la glutamine, mais avait diminué réponse à la stimulation du glucose. Les flux via GDH et glutaminase ont été mesurées par traçage de flux de 15N [2-15N] glutamine. Le transgène H454Y dans les îlots eu la sécrétion élevée d'insuline en réponse à la glutamine seul et avait 2 fois plus de flux GDH. Taux élevé de glucose inhibe à la fois glutaminase et le flux GDH, et la leucine ne pouvaient pas annuler cette inhibition. 15NH4Cl études de traçage ont montré 15N n'a pas été incorporé dans le glutamate soit dans les îlots H454Y transgéniques ou normale. En conclusion, nous avons généré un modèle de GDH-HI maladie de la souris qui a un phénotype hypoglycémie et a confirmé que la mutation H454Y du est une maladie causant. La stimulation de la libération d'insuline par la mutation H454Y GDH ou par activation leucine est associée à une désamination oxydative accrue de glutamate par l'intermédiaire GDH. Cette étude suggère que les fonctions de GDH principalement dans la direction de l'oxydation du glutamate plutôt que la synthèse du glutamate dans les îlots de souris et que ce flux est étroitement contrôlée par le glucose.
Induite Par L'ifosfamide Néphrotoxicité: Mécanisme Et Prévention
L'efficacité de l'ifosfamide (IFO), un médicament anticancéreux, est sévèrement limitée par une incidence élevée de la néphrotoxicité d'étiologie inconnue. Nous émettons l'hypothèse que l'inhibition du complexe I (CI) par chloroacétaldéhyde (CAA), un métabolite de l'IFO, est la principale cause de la néphrotoxicité, et que l'agmatine (AGA), que nous avons trouvé pour augmenter la phosphorylation oxydative mitochondriale et la bêta-oxydation, permettrait d'éviter néphrotoxicité. Notre système modèle a été obtenu à partir de mitochondries isolées du cortex rénal des rats traités avec IFO ou IFO + AGA. Phosphorylation oxydative a été déterminée avec des donneurs d'électrons spécifiques aux complexes I, II, III ou IV (CI, C-II, C-III, IV ou C-, respectivement). Une étude parallèle a été fait avec (13) C-étiquetés pyruvate pour évaluer la dysfonction métabolique. Traitement ifosfamide inhibé de manière significative la phosphorylation oxydative avec des substrats CI seulement. Inhibition de la CI a été associée à une élévation significative de [NADH], l'épuisement des [NAD], et une diminution de flux à travers la pyruvate déshydrogénase et le cycle de Krebs. Cependant, l'administration de l'AGA avec IFO a augmenté [AMP cyclique (AMPc)] et empêché IFO induite par l'inhibition de la CI. Des études in vitro avec différents métabolites de l'IFO a montré que seulement CAA inhibée CI, même avec une supplémentation en 2-mercaptoéthane acide sulfonique. Après le traitement IFO par jour pendant 5 jours avec 50 mg / kg, le niveau de la CAA dans le cortex rénal était d'environ 15 micromol / L. Pris ensemble, ces observations soutiennent l'hypothèse que la CAA est accumulée dans le cortex rénal et est responsable de la néphrotoxicité. AGA peut avoir un effet protecteur par un tissu plus en plus [AMPc], qui phosphoryle NADH: oxydoréductase. Les résultats actuels peuvent avoir des implications importantes pour la prévention de la néphrotoxicité induite par l'IFO et / ou les maladies mitochondriales secondaires à un défaut de CI.
Le Régime Cétogène Et Le Métabolisme Du Cerveau Des Acides Aminés: La Relation à L'effet Anticonvulsivant
Dans de nombreux patients épileptiques, des anticonvulsivants, soit ne pas suffisamment pour contrôler les convulsions ou qu'ils causent des effets secondaires graves. Un complément important à la pharmacothérapie est le régime cétogène, ce qui améliore souvent le contrôle des crises, même chez les patients qui répondent mal aux médicaments. Les mécanismes qui expliquent l'effet thérapeutique ne sont pas complètement compris. Les faits donnent raison à un effet sur la manipulation du cerveau des acides aminés, l'acide glutamique en particulier, le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central. Le régime alimentaire peut limiter la disponibilité de l'oxaloacétate à la réaction d'aspartate aminotransférase, une voie importante de la manipulation du glutamate du cerveau. En conséquence, plus le glutamate devient accessible à la réaction du glutamate décarboxylase pour donner acide gamma-aminobutyrique (GABA), le principal neurotransmetteur inhibiteur et d'un agent anticonvulsivant important. En outre, le régime cétogène semble favoriser la synthèse de la glutamine, un précurseur essentiel de GABA. Cela se produit à la fois parce que le carbone des corps cétoniques est métabolisé en glutamine et parce que dans la cétose il est augmentation de la consommation d'acétate, qui astrocytes dans le cerveau se transforment rapidement en glutamine. Le régime cétogène peut aussi faciliter les mécanismes par lesquels les exportations du cerveau à des composés sanguins tels que la glutamine et d'alanine, dans le processus favorisant l'élimination du carbone et d'azote glutamate.
Au-delà De La Glycolyse Aérobie: Cellules Transformées Peuvent S'engager Dans Métabolisme De La Glutamine Cela Dépasse L'exigence Pour Les Protéines Et La Synthèse Des Nucléotides
Prolifération des cellules tumorales nécessite synthèse rapide de macromolécules comprenant des lipides, des protéines, et les nucléotides. Beaucoup de cellules tumorales présentent la consommation de glucose rapide, avec la plupart du carbone du glucose dérivé être sécrétée sous forme de lactate, malgré la disponibilité en oxygène en abondance (l'effet Warburg). Ici, nous avons utilisé la spectroscopie RMN 13C pour examiner le métabolisme des cellules de glioblastome présentant glycolyse aérobie. Dans ces cellules, l'acide tricarboxylique (TCA) cycle était active, mais a été caractérisé par un efflux de substrats pour l'utilisation dans les voies de biosynthèse, la synthèse des acides gras en particulier. Le succès de cette activité de synthèse dépend de l'activation des voies pour générer une puissance réductrice (NADPH) et de rétablir l'oxaloacétate pour la fonction de cycle continu TCA (anaplerosis). Étonnamment, ces deux besoins ont été satisfaits par un taux élevé de métabolisme de la glutamine. Tout d'abord, la conversion de glutamine en lactate (glutaminolysis) était assez rapide pour produire du NADPH suffisante pour soutenir la synthèse des acides gras. Deuxièmement, malgré métabolisme du pyruvate mitochondrial substantielle, carboxylation du pyruvate a été supprimée, et de l'oxaloacétate anaplérotique a été dérivée à partir de la glutamine. Catabolisme glutamine est accompagnée par la sécrétion de l'alanine et de l'ammoniac, de telle sorte que la plupart des groupes aminés à partir de la glutamine ont été perdues à partir de la cellule non incorporés dans d'autres molécules. Ces données démontrent que les cellules transformées présentent un taux élevé de la consommation de glutamine qui ne peut pas être expliquée par la demande en azote imposée par la synthèse des nucléotides ou d'entretien des piscines d'acides aminés non essentiels. Plutôt, métabolisme de la glutamine fournit une source de carbone qui facilite la capacité des cellules à utiliser le glucose dérivé de carbone et intermédiaires du cycle de TCA en tant que précurseurs biosynthétiques.
3-isobutylméthylxanthine Inhibe La Synthèse De L'urée Hépatique: La Protection Par Agmatine
Nous avons précédemment montré que ureagenesis hépatique agmatine stimulé. Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer si l'action de l'agmatine est médiée via la signalisation de l'AMPc. Une expérience pilote a démontré que l'inhibiteur de la phosphodiestérase, 3-isobutylméthylxanthine (IBMX), inhibe la synthèse d'urée a augmenté bien [AMPc]. Ainsi, nous avons supposé que IBMX inhibe la synthèse de l'urée hépatique indépendante de [AMPc]. Nous avons en outre émis l'hypothèse que l'agmatine irait à l'encontre de l'action IBMX et d'améliorer ureagenesis. Des expériences ont été réalisées avec des mitochondries isolées et (15) NH (4) Cl pour tracer [(15) N] la production citrulline ou [5 - (15) N] glutamine et un système de perfusion de foie de rat de retracer ureagenesis. Les résultats démontrent que IBMX induit ce qui suit: (i) l'inhibition de la chaîne respiratoire mitochondriale et une diminution de O (2) la consommation pendant la perfusion du foie, (ii) l'épuisement de la capacité de phosphorylation hépatique potentielle et globale énergétique; (iii) l'inhibition de la [( 15) N] synthèse citrulline, et (iv) l'inhibition de la production d'urée de la perfusion du foie avec peu d'effet sur [N-acétylglutamate]. Les résultats indiquent que IBMX directement et spécifiquement inhibée complexe I de la chaîne respiratoire et carbamoyl-phosphate synthase-I (CPS-I), avec un CE (50) d'environ 0,6 mm en dépit d'une élévation significative des enzymes hépatiques [AMPc]. La perfusion de l'agmatine avec IBMX stimulé O (2) la consommation, restauré potentiel de phosphorylation hépatique et ureagenesis stimulé de façon significative. L'action de l'agmatine peut signifier un effet de cascade initiée par la phosphorylation oxydative accrue et une plus grande synthèse de l'ATP. En outre, l'agmatine peut empêcher l'IBMX de se lier à un ou plusieurs site (s) actif du CPS-I et ainsi protéger contre l'inhibition de la CPS-I. Ensemble, les données peuvent suggérer une nouvelle application expérimentale de IBMX dans les études de CPS-I dysfonctionnement et l'utilisation de l'agmatine en tant que thérapie d'intervention.
N-carbamylglutamate Améliore De Façon Marquée Dans La N-Ureagenesis Acétylglutamate Carence Et L'acidémie Propionique Mesurée Par L'incorporation Isotopique Et Biomarqueurs Sanguins
N-acétylglutamate (NAG) est un cofacteur endogène essentielle pour la conversion de l'ammoniac en urée dans le foie. Déficit de la NAG hyperammoniémie causes et se produit parce que la carence en a hérité de son enzyme productrice, NAG synthase (NAGS), ou d'interférence avec sa fonction par de courtes dérivés d'acides gras. N-carbamylglutamate (NCG) peut améliorer hyperammoniémie d'une carence en NAGS et acidémie propionique et méthylmalonique. Nous avons développé un isotope stable (13) C traceur méthode pour mesurer ureagenesis et d'évaluer l'effet de NCG chez les humains. Dix-sept adultes en bonne santé ont été étudiés pour l'incorporation de (13) l'étiquette C en urée. [(13) C] urée est apparu dans le sang en quelques minutes, atteignant au maximum de 100 min, tandis que le souffle (13) CO (2) atteint un maximum de 60 min. Un patient présentant un déficit NAGS montré l'étiquetage d'urée très peu de temps avant le traitement par le CNE et l'étiquetage normale par la suite. En conséquence, les concentrations plasmatiques de l'ammoniaque et de glutamine a nettement diminué et l'urée ont triplé après NCG traitement. De même, chez un patient à l'acidémie propionique, le traitement NCG a entraîné une augmentation marquée de l'étiquetage d'urée et la diminution de la glutamine, l'alanine et de glycine. Ces résultats fournissent une méthode fiable pour mesurer l'effet de la NCG sur le métabolisme d'azote et suggèrent fortement que le CNE pourrait être un traitement efficace pour le déficit hérité de NAGS et secondaire.
Élimination Des Canaux KATP Dans Les Résultats îlots De Souris Dans Elevated [U-13C] Métabolisme Du Glucose, Glutaminolysis, Et Le Cyclisme Pyruvate Mais Un Shunt Acide Gamma-aminobutyrique Diminution
Cellules bêta pancréatiques sont hyper-sensibles aux acides aminés, mais ont diminué la sensibilité du glucose après la suppression du récepteur 1 sulfonylurée (SUR1) à la fois chez l'homme et la souris. Il a émis l'hypothèse que ces défauts sont la conséquence de l'intégration avec facultés affaiblies d'un acide aminé, le glucose et le métabolisme énergétique dans les cellules bêta. Nous avons utilisé la méthodologie de spectrométrie de masse chromatographie en phase gazeuse pour étudier le métabolisme intermédiaire de SUR1 knock-out (SUR1 (- / -)) et les îlots de souris de contrôle avec d-[U-(13) C] glucose comme substrat et liée aux résultats de la sécrétion d'insuline . Les niveaux et l'étiquetage des isotopes de l'alanine, l'aspartate, le glutamate, la glutamine et acide gamma-aminobutyrique (GABA) ont servi d'indicateurs du métabolisme intermédiaire. Nous avons constaté que le shunt GABA de SUR1 (- / -) îlots est bloqué par environ 75% et a montré que ce défaut est dû à la synthèse de glutamate décarboxylase a diminué, probablement causée par élévation du calcium intracellulaire libre. Glutaminolysis stimulée par la leucine d analogique, l-beta-2-amino-2-norbornane-carboxylique a été, toutefois, améliorée dans SUR1 (- / -) et le glyburide-traitée SUR1 (+ / +) îlots. L'oxydation du glucose et le cyclisme pyruvate a été augmenté en SUR1 (- / -) îlots à faible taux de glucose, mais était le même que dans les contrôles à forte concentration de glucose. Isoformes enzyme malique 1, 2 et 3, impliqués dans le cyclisme pyruvate, ont tous été exprimé dans les îlots. Taux élevé de glucose réduit l'aspartate et stimulé la synthèse de glutamine même dans les contrôles et SUR1 (- / -) îlots. Les données suggèrent que l'interruption du shunt GABA et le manque de régulation du glucose du cyclisme pyruvate peut causer de l'insensibilité du glucose de l'SUR1 (- / -) îlots, mais que le cyclisme pyruvate renforcée basale, abaissé flux shunt GABA, et améliorent les capacités glutaminolytic peut sensibiliser les cellules bêta à la stimulation acide aminé.
Myc Régule Un Programme De Transcription Qui Stimule Glutaminolysis Mitochondriale Et Conduit à La Toxicomanie Glutamine
Les cellules de mammifères alimenter leur croissance et leur prolifération à travers le catabolisme de deux substrats principaux: le glucose et la glutamine. La plupart des métabolites restants prises par les cellules proliférantes sont pas catabolisée, mais sont plutôt utilisés comme blocs de construction lors de la synthèse macromoléculaire anabolisant. Les enquêtes sur les phospho-3-kinase (PI3K) et de son effecteur en aval AKT ont confirmé que ces oncogènes jouent un rôle direct dans la captation du glucose et du métabolisme stimulant, ce qui rend la cellule transformée accro au glucose pour le maintien de la survie. En revanche, on en sait moins sur la régulation de l'absorption et le métabolisme glutamine. Ici, nous déclarons que les propriétés régulation de la transcription de l'oncogène Myc coordonner l'expression des gènes nécessaires pour les cellules de s'engager dans le catabolisme de la glutamine qui dépasse l'exigence cellulaire pour les protéines et la biosynthèse des nucléotides. Une conséquence de cette glutaminolysis Myc-dépendante est la reprogrammation du métabolisme mitochondrial de dépendre sur le catabolisme de la glutamine pour assurer la viabilité cellulaire et anapleurosis cycle de Krebs. La capacité de Myc cellules exprimant à s'engager dans glutaminolysis ne dépend pas de l'activation simultanée de PI3K ou AKT. La stimulation du métabolisme mitochondrial glutamine entraîné en carbone du glucose réduit entrant dans le cycle TCA et une baisse de la contribution de glucose à la synthèse mitochondriale dépendante des phospholipides. Ces données suggèrent que les niveaux de oncogènes Myc induire un programme qui favorise la transcription glutaminolysis et déclenche la dépendance cellulaire pour la glutamine comme un substrat bioénergétique.
La Cétose Et La Manipulation Du Cerveau De Glutamate, La Glutamine, Et Le GABA
Nous émettons l'hypothèse qu'un mécanisme de l'effet anti-épileptique de la diète cétogène est de modifier la manipulation du cerveau du glutamate. Selon cette formulation, dans le métabolisme cérébral astrocytes cétosique est plus actif, résultant de la conversion accrue de glutamate en glutamine. Cela permet de: (a) le déménagement beaucoup plus efficace de glutamate, le neurotransmetteur excitateur le plus important, et (b) une conversion plus efficace de la glutamine au GABA, principal neurotransmetteur inhibiteur.
Effets D'une Dose Unique De N-carbamylglutamate Sur Le Taux De Ureagenesis
Nous avons étudié l'effet sur ureagenesis d'une dose unique de N-carbamylglutamate (NCG) en bonne santé chez les jeunes adultes qui ont reçu une perfusion constante (300 min) de NaH (13) CO (3). Rapport isotopique-spectrométrie de masse est utilisé pour mesurer l'apparition du marqueur dans [(13) C] urée. A 90 min après le début de la H (13) CO3-perfusion chaque sujet a pris une dose unique de NCG (50 mg / kg). Dans 5/6 études de l'administration de la NCG a augmenté la formation de [(13) C] urée. Le traitement par NCG considérablement réduit la concentration d'alanine sang, mais pas celle de la glutamine ou l'arginine. La concentration en glucose du sang n'a pas été affectée par l'administration NCG. Pas d'effets secondaires indésirables ont été observés. Les données indiquent que le traitement avec le CNE stimule ureagenesis et pourrait être utile dans les milieux cliniques de hyperammoniémie aiguë de diverses étiologies.
Mesure En Ureagenesis Vivo Avec Des Isotopes Stables
Les isotopes stables ont été un complément précieux à la recherche biomédicale pour les plus de 70 années. En effet, l'approche isotopique a révolutionné notre compréhension du métabolisme, révélant qu'il s'agit d'un processus intensément dynamique caractérisé par un cycle sans fin de la synthèse et la dégradation. Les études isotopiques nous ont appris que le cycle de l'urée est intrinsèque à un tel dynamisme, car elle offre un mécanisme de grande capacité permettant de déchets à éliminer l'azote lorsque les taux de dégradation des protéines (ou apport en protéines alimentaires) sont particulièrement élevés. Isotopes ont permis une appréciation de la mesure dans laquelle ureagenesis est compromise chez les patients présentant des défauts cycle de l'urée. En effet, les études isotopiques de flux cycle de l'urée sont bien corrélés avec la sévérité de la déficience cognitive chez ces patients. Enfin, l'utilisation des isotopes offre un outil idéal pour évaluer l'efficacité des interventions thérapeutiques afin d'augmenter le flux résiduel à travers le cycle.
Down-régulation De La Synthèse Hépatique D'urée Par Oxypurines: Acide Urique Xanthine Et D'inhibition De N-acétylglutamate Synthase
Nous avons précédemment rapporté que isobutylméthylxanthine (IBMX), un dérivé de oxypurine, inhibe la synthèse de la citrulline par un mécanisme encore inconnu. Ici, nous démontrons que oxypurines IBMX et d'autres contenant un groupe 2,6-dione interférer avec la liaison du glutamate dans le site actif de la N-acétylglutamate synthétase (NAGS), diminuant ainsi la synthèse des N-acétylglutamate, l'obligatoire activateur de carbamoyle phosphate synthase-1 (CPS1). Le résultat est la réduction de la citrulline et de synthèse d'urée. Des expériences ont été réalisées avec (15) N-substrats marqués, purifié CPS1 hépatiques, et NAGS souris recombinantes ainsi que mitochondries isolées. Nous avons également utilisé des hépatocytes isolés pour examiner l'action des différents oxypurines sur ureagenesis et d'évaluer l'effet améliorant de la N-carbamylglutamate et / ou la L-arginine sur l'inhibition de NAGS. Parmi oxypurines différents testés, que l'IBMX, la xanthine, l'acide urique ou sensiblement augmenté l'apparente K (m) pour le glutamate et une diminution de la vitesse de NAGS, avec peu d'effet sur CPS1. L'inhibition de la NAGS est temps-et dose-dépendante et conduit à la formation ont diminué de l'inhibition CPS1-N-acétylglutamate complexe et par conséquent de la citrulline et synthèse de l'urée. Toutefois, une telle inhibition a été renversée par une supplémentation en N-carbamylglutamate. Les données démontrent que l'acide urique et la xanthine, les deux oxypurines physiologiquement survenus, inhibent la synthèse hépatique de N-acétylglutamate. Un concept important et nouveau qui émerge de cette étude est que la xanthine et / ou d'acide urique peut avoir un rôle dans la régulation de ureagenesis et, par conséquent, l'homéostasie de l'azote dans les états normaux et pathologiques.
