Ayudar a Asignación Funcional Para Hipotéticos Heamophilus Influenzae Productos Del Gen a Través De Genómica Estructural

Current Drug Targets. Infectious Disorders. Dec, 2002  |  Pubmed ID: 12570740

Las estructuras tridimensionales de Haemophilus influenzae proteínas cuyas funciones biológicas son desconocidas se está determinando como parte de un proyecto de Genómica estructural para preguntar si la información estructural puede ayudar en la asignación de las funciones de las proteínas. Las estructuras de las proteínas hipotéticas se utilizan para guiar más estudios y acotar el campo de tales estudios para determinar en última instancia, la función de la proteína. Un esbozo de la metodología de Genómica estructural se proporciona junto con los resúmenes de un número de terminado y en progreso cristalográfica y RMN las determinaciones de la estructura. Con más de veinticinco estructuras determinadas en este punto y muchos más en diferentes fases de ejecución, los resultados son alentadores en que cierto nivel de entendimiento funcional puede deducirse de estructuras experimentalmente solucionadas. Además de ayudar en la asignación funcional, este esfuerzo es identificar un número de posibles nuevos objetivos para el desarrollo de fármacos.

De La Estructura De La Función: YrbI De Haemophilus Influenzae (HI1679) Es Una Fosfatasa

Proteins. Mar, 2002  |  Pubmed ID: 11835514

La estructura cristalina de la proteína YrbI de Haemophilus influenzae (HI1679) se determinó en un 1.67 resolución. La función de la proteína no había sido asignada previamente, y se anota como hipotético en bases de datos de secuencia. La proteína exhibe el doblez de la Alfa/beta-hidrolasa (también llamado el pliegue Rossmann) y asemeja más estrechamente al redil de la superfamilia de dehalogenase (HAD) L-2-haloacid. Después de esta observación, un análisis de la secuencia detallada reveló homología remoto a dos miembros de la superfamilia de la HAD, el P-dominio de la ATPasa CA y Fosfoserina fosfatasa. Las cadenas de 19 kDa de HI1679 forman un tetrámero en solución y en la forma cristalina. Los cuatro monómeros están dispuestos en un anillo tal que cuatro lazos de beta-horquilla, cada uno después de la primera beta-strand de la base Alfa/beta-fold, forman un cañón de ocho hebra en el centro de la Asamblea. Cuatro sitios activos se encuentran en las interfaces de la subunidad. Cada sitio activo está ocupado por un ion de cobalto, un metal utilizado para la cristalización. El cobalto es octahedrally coordinado para dos cadenas laterales de aspartato, un oxígeno de la espina dorsal y tres moléculas solventes, indicando que el metal fisiológico puede ser magnesio. HI1679 hidroliza un número de fosfatos, incluyendo 6-fosfogluconato y phosphotyrosine, sugiriendo que funciona como una fosfatasa in vivo. El sustrato fisiológico que todavía se identifica; sin embargo la ubicación del gen en el operón yrb sugiere la implicación en el metabolismo del azúcar.

Estructura De Escherichia Coli Aminodeoxychorismate Sintasa: Conservación Arquitectónica Y La Diversidad En Corismato-utilizando Enzimas

Biochemistry. Feb, 2002  |  Pubmed ID: 11841211

Aminodeoxychorismate sintasa es parte de un complejo que cataliza la biosíntesis de dos etapas de 4-amino-4-deoxychorismate, un precursor de p-aminobenzoato y folato en microorganismos de heterodiméricos. En el primer paso, un amidotransferase de glutamina codificada por el gen de la pabA genera amoníaco como sustrato que, junto con corismato, se utiliza en el segundo paso, catalizado por la aminodeoxychorismate sintasa, el producto del gen pabB. Presentamos la estructura cristalina de rayos x de Escherichia coli PabB determinada en dos formas diferentes de cristal, cada una con 2.0 una resolución. El PabB monomérica 453 residuos tiene un pliegue complejo Alfa/beta que es similar a la observada en las estructuras homólogas, oligoméricas 2440mm subunidades de varios antranilato sintasa de origen microbiano. Una comparación de las estructuras de estas dos clases de corismato-utilizando enzimas proporciona un fundamento para las diferencias en las estructuras cuaternarias de estas enzimas e indica que la Asociación débil o transitoria de PabB con PabA durante catálisis proviene al menos en parte de una interfaz limitada para las interacciones de la proteína. Análisis adicionales de las estructuras permitieron la identificación provisional del sitio activo de PabB, que contiene una serie de residuos implicado de anteriores estudios bioquímicos y genéticos, esencial para la actividad. Las diferencias en las estructuras que se determina a partir de cristales de fosfato y formiato-cultivados y la ubicación de un ión formiato adventicias, sugieren que los cambios conformacionales en bucle regiones adyacentes al sitio activo pueden ser necesario para la catálisis. Un hallazgo sorprendente en la estructura de PabB fue la presencia de una molécula de triptófano arraigada en un bolsillo de Unión que es análogo al sitio reglamentario en las subunidades 2440mm del antranilato sintasa. El ligando fuertemente consolidado, que no puede disociarse sin desnaturalización de PabB, puede desempeñar un papel estructural en la enzima ya que no hay ningún efecto de triptófano en la síntesis enzimática de aminodeoxychorismate. Similitud de secuencia extensa en el bolsillo de triptófano vinculante entre varias otras enzimas corismato-utilizando, incluyendo isochorismate synthase, sugiere que también puede enlazar el triptófano para la integridad estructural y corrobora las ideas iniciales sobre la evolución de esta interesante familia de enzima.

Termodinámica De Reacciones Catalizadas Por PABA Sintasa

Biophysical Chemistry. Apr, 2002  |  Pubmed ID: 11975992

Microcalorimetría y alto rendimiento de cromatografía líquida (HPLC) se han utilizado para llevar a cabo una investigación termodinámica de reacciones catalizadas por PABA sintasa, la enzima que se encuentra en el primer paso en el camino de ácido metabólico shikímico hacia de corismato 4-aminobenzoato (PABA). La reacción general bioquímica catalizada por los componentes PabB y PabC de PABA sintasa es: chorismate(aq)+ammonia(aq)=4-aminobenzoate(aq)+pyruvate(aq)+H(2)O(l). Esta reacción puede dividirse en dos reacciones parciales involucrando el intermedio 4-amino-4-deoxychorismate (ADC): chorismate(aq)+ammonia(aq)=ADC(aq)+H(2)O(l) y ADC(aq)=4-aminobenzoate(aq)+pyruvate(aq). Microcalorimetric mediciones se realizaron en los tres de estas reacciones a una temperatura de valores 298.15 K y pH en el rango 8,72-8.77. Equilibrio las mediciones se realizaron en la primera reacción parcial de (ADC sintasa) en T = 298.15 K y pH = 8,78. El molality de saturación de 4-aminobenzoate(cr) en agua es (0.00382 +/-0.0004) kilogramo mol en T = 298.15 K. Se analizaron los resultados del equilibrio y medidas calorimétricas en términos de un modelo de equilibrio químico que tenga en cuenta la multiplicidad de Estados iónicos de los reactivos y productos. Estos cálculos dieron cantidades termodinámicas la temperatura 298.15 K y una fuerza iónica de cero para reacciones químicas referencia que implican formas iónicas específicas. Para la reacción: chorismate(2-)(aq)+NH(4)(+)(aq)=ADC(-)(aq)+H(2)O(l), K=(10.8+/-4.2) y mol(-1) Delta(r)H(m)(o)=-(35+/-15) kJ. Para la reacción: ADC(-)(aq)=4-aminobenzoate(-)(aq)+pyruvate(-)(aq)+H(+)(aq), mol(-1) Delta(r)H(m)(o)=-(139+/-23) kJ. Para la reacción: chorismate(2-)(aq)+NH(4)(+)(aq)=4-aminobenzoate(-)(aq)+pyruvate(-)(aq)+H(2)O(l)+H(+)(aq), mol(-1) Delta(r)H(m)(o)=-(174+/-6) kJ. Ciclo termodinámico cálculos se utilizaron para calcular cantidades termodinámicas para tres reacciones adicionales que utilizan L-glutamina en lugar de amoniaco y que son pertinentes a este punto de la bifurcación de la vía ácido shikímico. Las cantidades obtenidas en este estudio permiten el cálculo de la posición de equilibrio de estas reacciones en función de la temperatura, pH y fuerza iónica. Valores de las constantes de equilibrio aparente y el estándar transforman cambios de energía de Gibbs se dan Delta(r)G'(m)(o) bajo condiciones fisiológicas aproximadamente.

Estructura Cristalina De YbaB De Haemophilus Influenzae (HI0442), Una Proteína De Función Desconocida Coexpressed Con La Proteína De Reparación De ADN Recombinational RecR

Proteins. Feb, 2003  |  Pubmed ID: 12486730

Estructura Y Mecanismo De Pseudomonas Aeruginosa PhzD, Un Isochorismatase De La Vía Biosintética Fenazina

Biochemistry. May, 2003  |  Pubmed ID: 12741825

PhzD de Pseudomonas aeruginosa es una isochorismatase implicado en la biosíntesis de Fenazina. Phenazines son compuestos antimicrobianos que proporcionan una ventaja competitiva en determinados entornos de Pseudomonas y pueden ser en parte responsable de la persistencia de infecciones por Pseudomonas. En vivo, PhzD cataliza la hidrólisis del grupo vinilo éter funcional de 2-amino-2-deoxyisochorismate, piruvato y ácido trans-2, 3-dihidro-3-hidroxi, que luego se utiliza en la vía biosintética Fenazina. PhzD también cataliza la hidrólisis de los relacionados con vinilo éteres isochorismate corismato y 4-amino-4-deoxychorismate. Aquí divulgamos la estructura de cristal A 1,5 de PhzD nativo y la estructura A 1.6 de la variante D38A inactiva en complejo con isochorismate. Las estructuras revelan que isochorismate se une al sitio activo PhzD en una conformación trans-diaxial y superposición de las estructuras indica que el carbono pyruvyl metileno isochorismate colinda con el lado cadena carboxilato de aspartato 38. La proximidad del aspartato 38 isochorismate y la pérdida completa de actividad resultante de la conversión de aspartato 38 a alanina sugieren un mecanismo en el cual el carboxilato actúa como un ácido general para protonate el sustrato, produciendo un ión Carbocatión/oxocarbonium es entonces rápidamente hidratado para formar un hemiketal intermedio, que luego se descompone espontáneamente a los productos. La estructura de PhzD es notablemente similar a otras estructuras de la subfamilia de las enzimas Alfa/beta-hidrolasa que incluye pirazinamidasa y amidohidrolasa N-carbamoylsarcosine. Sin embargo, PhzD cataliza relacionado con química y carece de una cisteína nucleofílica en sus parientes cercanos estructurales. La hidrólisis de éter vinilo catalizada por PhzD representa otro ejemplo de la diversidad catalítica en la familia de Alfa/beta-hidrolasa, cuyos miembros también son conocidos para hidrolizar amidas, fosfatos, fosfonatos, epóxidos y bonos C-X.

Elementos Estructurales Conservados En Homólogos De Transferasa De Glutatión Codificadas En El Genoma De Escherichia Coli

Proteins. Dec, 2003  |  Pubmed ID: 14635120

Alineaciones múltiples de la secuencia de los ocho homólogos de transferasa de glutatión (GSH) codificadas en el genoma de Escherichia coli fueron utilizadas para definir una secuencia de consenso para las proteínas. La secuencia consenso fue analizada en el contexto de la estructura tridimensional del producto del gen de gst (EGST) obtenida de dos formas diferentes de cristal de la enzima. La enzima consiste en dos dominios. La región N-terminal (dominio I) tiene una tiorredoxina-como Alfa/beta-fold, mientras que el dominio c-terminal (dominio II) es todo alfa-helicoidal. La mayoría de los residuos de consenso (12/17) residen en el dominio N-terminal. Quince de los 17 residuos están implicados en las interacciones hidrofóbicas núcleo, vueltas o interacciones electrostáticas entre los dos dominios. Los resultados sugieren que todos los homólogos retienen un grupo claramente definido de elementos estructurales en tanto entre el dominio N-terminal de Alfa/beta y el dominio c-terminal. La conservación de dos residuos de claves para el motivo de reconocimiento para la gamma-glutamil-porción de GSH indica que los homólogos pueden interactuar con GSH o GSH análogos tales como glutathionylspermidine o alfa-aminoácidos. El contexto del genoma de dos de los homólogos constituye la base para una hipótesis que los productos de genes b2989 y yibF están involucrados en bioquímica glutathionylspermidine y selenio, respectivamente.

Paralelo Evolutivas Vías Para Glutatión Transferasa: Estructura Y Mecanismo De La Enzima Mitocondrial Clase Kappa RGSTK1-1

Biochemistry. Jan, 2004  |  Pubmed ID: 14717589

La transferasa de clase kappa glutatión (GSH) es una enzima que se encuentra en la matriz mitocondrial. Su relación con miembros de la superfamilia de transferasa GSH canónica sigue siendo un enigma. La estructura tridimensional de la enzima de kappa de la clase de rata (rGSTK1-1) en complejo con GSH ha sido resuelto por sustitución isomórfica solo con dispersión anómala con una resolución de 2.5 A. La estructura revela que la enzima está más estrechamente relacionada con la isomerasa proteína de Enlace disulfuro, dsbA, de Escherichia coli que es miembros de la Superfamilia canónica. Las estructuras de rGSTK1-1 y los miembros de la Superfamilia canónica indican que los pliegues de las proteínas se han apartado de un progenitor común de tiorredoxina/Reductasas pero lo hicieron por diferentes mecanismos. La enzima mitocondrial, por lo tanto, representa una cuarta Superfamilia de proteínas que soporta la actividad transferasa GSH. Las funciones de dominio tiorredoxina de manera similar a la observada en las enzimas canónicas aportando elementos estructurales claves para el reconocimiento de GSH. El grupo hidroxilo de S16 está a distancia de la Unión de hidrógeno del sulfuro de GSH encuadernado y es, en parte, responsable de la ionización de los grupos tiol en el E * complejo GSH (pKa = 6.4 +/-0.1). Preequilibrium experimentos cinéticos indican que la k(on) de GSH es 1 x 10 M(-1) s(-1) y k(off) para GS - es aproximadamente de 8 s(-1) y relativamente lento con respecto a la facturación con 1-cloro-2, 4-dinitrobenceno (CDNB). Como resultado, el KM(GSH) (11 mM) es mucho mayor que la aparente Kd(GSH) (90 microM). El sitio activo tiene un canal de acceso relativamente abierto que está flanqueado por los lazos desordenados que pueden explicar el número relativamente alta rotación (280 s(-1) a pH 7,0) hacia CDNB. Los lazos desordenados forman un gran parche contiguo a una cara de la enzima dimérica, un hecho que sugiere que la superficie de la proteína puede interactuar con una membrana y otro socio de la proteína.

Asignación De NMR De La Proteína Hipotética HI0004 De Haemophilus Influenzae--un Producto De Putativo Gen Esencial

Journal of Biomolecular NMR. May, 2004  |  Pubmed ID: 15017148

Estructura Y Función De La Proteína De La Biosíntesis De Fenazina PhzF De Pseudomonas Fluorescens 2-79

Biochemistry. Oct, 2004  |  Pubmed ID: 15449932

Phenazines, incluyendo piocianina y iodonin, son compuestos biológicamente activos que se creen que otorgan organismos productores con una ventaja de crecimiento competitivo y también se cree que son factores de virulencia en ciertas enfermedades como la fibrosis quística. El sistema de anillo básico, tricíclicos Fenazina se sintetiza en una serie de pasos mal caracterizados por las enzimas codificadas en un cistron siete genes en Pseudomonas y otros organismos. A pesar de la importancia biológica de estos compuestos y nuestra comprensión de su modo de acción, la bioquímica y los mecanismos de biosíntesis de Fenazina no se resuelven bien. Presentamos la estructura de cristal A 1.8 de PhzF, una enzima clave en la biosíntesis de Fenazina, resuelto por el reemplazo molecular. PhzF es estructuralmente similar a la enzima biosintética diaminopimelate epimerase de lisina, un pliegue inusual que consiste en dos dominios casi idénticos con el sitio activo situado en una hendidura ocluido entre los dominios. A diferencia de diaminopimelate epimerase, PhzF es un dímero de solución. Los dos aparentemente sitios independientes activos abrir hacia lados opuestos del dimer y son ocupados por los iones sulfato en la estructura. Experimentos in vitro usando una mezcla de purificada PhzF, - A, -B y G - confirman que Fenazina-1-carboxílico (PCA) se produce fácilmente de trans-2, 3-dihidro-3-hidroxi ácido (DHHA) sin ayuda de otros factores celulares. PhzA, -B y - G no tienen actividad hacia DHHA. Sin embargo, en presencia del PhzF, individualmente o en combinaciones, aceleran la formación de la PCA de DHHA y por lo tanto parecen funcionar sorprendentemente después de la acción de PhzF., PhzF es capaz de producir PCA, aunque lentamente, desde DHHA. Estas observaciones sugieren que PhzF cataliza el paso inicial en la conversión de DHHA a la ACP, probablemente por una reacción de reordenamiento que rinde el análogo más reactivo 3-oxo DHHA, y que realizar los siguientes pasos pueden ocurrir espontáneamente. Un modelo hipotético para cómo DHHA se une al sitio activo PhzF sugiere que Glu45 y Asp208 podrían actuar como catalizadores de ácido-base generales en una reacción de reordenamiento. Dado que se encuentran cuatro reacciones entre DHHA y PCA, formación de la cetona, la formación del anillo, descarboxilación y oxidación, presumimos que las proteínas similares de PhzA y B - catalizan la formación del anillo y así pueden ser más que noncatalytic proteínas accesorias. PhzG es sin duda una oxidasa y se prevé que catalice la reacción de oxidación/aromatización final.

Estructura De La Enzima De La Biosíntesis De Fenazina PhzG

Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. Nov, 2004  |  Pubmed ID: 15502343

PhzG es una oxidasa de flavin-dependiente que se cree que desempeñan un papel en la síntesis de antibióticos de Fenazina en varias bacterias, incluyendo Pseudomonas. Phenazines son derivados del ácido corísmico que proporcionan los organismos productores, incluyendo el patógeno oportunista de p. aeruginosa, con una ventaja de crecimiento competitivo. Aquí, las estructuras de cristal de PhzG de p. aeruginosa y p. fluorescens solucionado en un estado de unliganded a 1.8 y 1.9 una resolución, respectivamente, se describen. Aunque se desconoce la reacción específica en la biosíntesis de Fenazina catalizada por PhzG, los datos estructurales indican que PhzG está estrechamente relacionado con piridoxina-5'-fosfato oxidasa, el producto del gene Escherichia coli pdxH, que cataliza el paso final en la biosíntesis de-5'-fosfato de piridoxal (PLP). Una propuesta anterior sugiere que el sustrato fisiológico de PhzG a ser 2, 3-dihidro-3-hidroxi ácido (DHHA), un precursor de Fenazina producido por las acciones secuenciales de la PhzE y PhzD enzimas corismato, y dos moléculas DHHA dimerized en otra reacción catalizada por la enzima para producir Fenazina-1-carboxilato. Sin embargo, no fue posible demostrar cualquier actividad in vitro sobre incubación de PhzG y DHHA. Curiosamente, el análisis de las actividades in vitro de PhzG en combinación con PhzF sugiere que PhzF actúa en DHHA y que PhzG luego reacciona con un precusor de Fenazina tricíclicos no aromáticos para catalizar una reacción de oxidación/aromatización que rinde Fenazina-1-carboxilato. Se propone que phzG se presentó por la duplicación de pdxH y que las diferencias sutiles entre las estructuras de PhzG y PdxH se correlacionan con la pérdida de la capacidad de PhzG para catalizar la formación de PLP. Alineaciones de la secuencia y superposiciones de los sitios activos de PhzG y PdxH revelan que los residuos que forman un bolsillo cargado positivamente alrededor del fosfato del PLP en el complejo PdxH-PLP no se conservan en PhzG, consistente con la incapacidad de compuestos fosforilados para servir como sustratos para PhzG.

Estructura De NMR De HI0004, Un Producto Del Gen Esencial Putativos De Haemophilus Influenzae Y Comparación Con La Estructura De La Radiografía De Un Homólogo De Aquifex Aeolicus

Protein Science : a Publication of the Protein Society. Feb, 2005  |  Pubmed ID: 15632286

La estructura de la solución del 154-residuo conservado proteína hipotética que hi0004 ha determinado usando la Espectroscopia NMR de multidimensional heteronuclear. HI0004 tiene homólogos de secuencia en muchos organismos desde las bacterias hasta los seres humanos y se cree que es esencial para Haemophilus influenzae, aunque una función exacta aún tiene que definirse. Tiene una arquitectura de Alfa-beta-alfa sandwich que consiste en una central cuatro hebras beta-hoja con la hélice alpha2 llena contra un lado de la hoja beta y cuatro alfa hélices (alpha1, alpha3, alpha4, alpha5) en el otro lado. Hay homología estructural con la matriz eucariotas metaloproteasas (MMPs), pero poca similitud de secuencia excepto una región conservada que contiene tres histidinas que aparece en ambas las MMPs y a lo largo de la familia HI0004 de proteínas. La estructura de la solución del HI0004 se compara con la estructura de la radiografía de un homólogo de Aquifex aeolicus, AQ_1354, que tiene identidad de secuencia de 36% a 148 residuos. A pesar de este nivel de homología de secuencia, diferencias significativas existen entre las dos estructuras. Estas diferencias se describen junto con posibles implicaciones funcionales de las estructuras.

Doble Mutación En La Interfaz De La Subunidad De Glutatión Transferasa RGSTM1-1 Da Lugar a Un Monómero Estable, Doblado

Biochemistry. Feb, 2006  |  Pubmed ID: 16475815

Transferasas canónica glutatión (GSH) son proteínas dimérica con subunidades compuestas por una región de unión de GSH N-terminal (dominio 1) y una región helicoidal c-terminal (dominio 2). Las estabilidades de dímeros de transferasa GSH varias dependen de dos grupos de interacciones entre dominios 1 y 2 de subunidades de la oposición: un motivo de bola-y-zócalo hidrofóbico y un motivo de clúster de carga enterrados. En rGSTM1-1, estos motivos involucran residuos F56 y R81 los, respectivamente. La base estructural para los efectos de mutando F56 a diferentes residuos de dímero estabilidad y función ha sido informado (bioquímica de Codreanu et al (2005) 44, 10605-10612). Aquí, demostramos que la interrupción simultánea de ambos motivos en el mutante de F56S/R81A causa disociación completa del dimer a una proteína monomérica en base cromatografía de gel filtración y dispersión de la luz del láser de ángulo múltiple. La fluorescencia y propiedades de CD lejos-UV del doble mutante, así como la cinética de amida intercambio H/D a lo largo de la columna vertebral del polipéptido sugieren que el monómero tiene una estructura globular que es similar a una sola subunidad de la proteína nativa. Sin embargo, el monómero mutante ha deteriorado severamente actividad catalítica, sugiriendo que la interfaz de dímero es vital para la catálisis eficiente. Amida de la columna vertebral cinética de intercambio de H/D en los mutantes F56S y F56S/R81A indican que una reorganización de la estructura del lazo entre la hélice alfa2 y strand beta3 cerca el sitio activo es responsable de la disminución de la actividad catalítica del monómero. Además, el cruce de las hélices alpha4 y alpha5 en F56S/R81R muestra había disminuido intercambio de H/D, indicando otro cambio estructural que influyen en la catálisis. Aunque la interfaz nativa de la subunidad es importante para la estabilidad del dímero, urea-inducida despliegue del mutante F56S/R81A sugiere que la interfaz no es esencial para la estabilidad termodinámica de las subunidades individuales. Los datos de intercambio de H/D revelan una posible base molecular para la cooperatividad plegable observado entre los dominios 1 y 2.

Análisis Estructural Y Funcional De La Proteína Biosintético De Piocianina PhzM De Pseudomonas Aeruginosa

Biochemistry. Feb, 2007  |  Pubmed ID: 17253782

Piocianina es un Fenazina biológicamente activo producido por el patógeno humano Pseudomonas aeruginosa. Se piensa dotar a p. aeruginosa con una ventaja de crecimiento competitivo en tejido colonizado y también se cree que es un factor de virulencia en enfermedades como la fibrosis quística y SIDA donde pacientes comúnmente son infectados por patógenos Pseudomonas debido a su estado inmunocomprometido. Piocianina es también un químicamente interesante compuesto debido a su actividad inusual de oxidación-reducción. METOSULFATO-1-carboxílico, el precursor de las phenazines bioactivos, se sintetiza a partir de ácido corísmico por las enzimas codificadas en un cistron siete genes en p. aeruginosa y en otras Pseudomonas. Phenzine-1-carboxílico se cree debe ser convertido a piocianina por las acciones secuenciales de la supuesta PhzM de N-metiltransferasa de S-adenosilmetionina-dependiente y la supuesta hidroxilasa flavin-dependiente PhzS. Presentamos la estructura de cristal A 1.8 de PhzM determinado por sola dispersión anómala. A diferencia de muchos metiltransferasas, PhzM es un dímero de solución. El polipéptido de 36 kDa PhzM dobla en tres dominios. El dominio c-terminal exhibe el doblez de la Alfa/beta-hidrolasa típico de metiltransferasas de molécula pequeña. Dos pequeños dominios de N-terminal forman gran parte de la interfaz de dímero. Alineaciones estructurales con metiltransferasas conocidos muestran que PhzM es más similar a la planta O-metiltransferasas que se caracterizan por una interfaz inusual dímero entrelazados. La estructura del PhzM no contiene ligandos, y el sitio activo está abierto y expuestos al solvente en comparación con estructuras de enzimas similares. Experimentos in vitro utilizando solo purificada PhzM demuestran que tiene poca o ninguna capacidad de metilato de phenzine-1-carboxílico. Sin embargo, cuando la supuesta hidroxilasa PhzS está incluida, fácilmente se produce piocianina. Esta observación sugiere que un mecanismo ha evolucionado en p. aeruginosa que asegura la eficiente producción de piocianina mediante la prevención de la formación y liberación de un intermedio inestable y potencialmente perjudicial.

Estructura Cristalina De La Proteína Biosintético De Piocianina PhzS

Biochemistry. May, 2008  |  Pubmed ID: 18416536

El patógeno humano Pseudomonas aeruginosa produce piocianina, un derivado METOSULFATO de pigmentación azul, que se sabe para desempeñar un papel en virulencia. Piocianina se produce ácido corísmico vía el camino Fenazina, nueve proteínas codificadas por un racimo del gene. METOSULFATO-1-carboxílico, el METOSULFATO inicial formado, se convierte en piocianina en dos pasos que son catalizadas por las enzimas PhzM y PhzS. PhzM es una metiltransferasa dependiente adenosilmetionina PhzS es una hidroxilasa dependiente de flavin. Se ha demostrado que PhzM sólo es activo en la presencia física de PhzS, sugiriendo que una interacción proteína-proteína participa en la formación de piocianina. Tan complejo impediría la liberación de la 5-metil-fenazina-1-carboxilato, el supuesto intermediario y un compuesto al parecer inestable. Aquí, describimos la estructura tridimensional de PhzS, resuelto por dispersión anómala sola, en una resolución de 2.4 A. La estructura revela que PhzS es un miembro de la familia de hidroxilasas aromático caracterizado por p-hidroxibenzoato hidroxilasa. El cofactor de flavin de PhzS es en el solvente expuesto orientación típicamente visto en unliganded aromáticos hidroxilasas. El flavin PhzS, sin embargo, parece que se celebrará en una conformación filtrada por una combinación de apilamiento de las interacciones y enlaces de hidrógeno. La estructura sugiere que acceso al sitio activo se obtiene a través de un túnel en el lado opuesto de la proteína de donde se expone el flavin. La terminal C 23 residuos están trastornados como ninguna densidad del electrón está presente para estos átomos. La localización probable de la c-terminal, cerca del túnel de acceso de sustrato, sugiere que puede estar implicado en el enlace de sustrato como se ha demostrado para otro homólogo estructural, RebC. Esta región también puede ser un elemento de una interfaz de PhzM-PhzS. Hydroxylases aromáticos han demostrado para catalizar reacciones de sustitución electrófila en sustratos activados. El sustrato de PhzS supuesto, sin embargo, es electrón deficiente y es improbable que actúan como un nucleófilo, sugiriendo que el PhzS puede utilizar un mecanismo diferente que sus parientes estructurales.

Estructura De Isochorismate Synthase En Complejo Con Magnesio

Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. May, 2008  |  Pubmed ID: 18453696

El electrón portador menaquinone es uno de muchos metabolitos bacterianos importantes que se derivan del ácido corísmico intermedio clave. MenF, la primera enzima en la vía menaquinone, cataliza la isomerización de corismato a isochorismate. Aquí, se presenta una estructura mejorada de MenF en una nueva forma de cristal. La estructura, resuelto con resolución de 2.0 angstroms en complejo con magnesio, revela que una bien definida cerró el sitio activo. Evidencia sugiere que el mecanismo de la reacción catalizada por la MenF implica el ataque nucleofílico de la molécula de agua en el anillo de corismato. La estructura revela una molécula de agua definidas situada en una posición adecuada para la activación por Lys190 y ataque en el substrato.

Un Inositolphosphorylceramide Synthase Participa En La Regulación De La Muerte Celular Programada De La Planta Asociada Con Defensa En Arabidopsis

The Plant Cell. Nov, 2008  |  Pubmed ID: 19001565

El gen de resistencia de Arabidopsis thaliana RPW8 desencadena la respuesta hipersensible (HR) para restringir el oidio infección mediante la vía de señalización dependiente de ácido salicílico. Para entender más cómo se regula la señalización RPW8, hemos realizado una pantalla genética para identificar mutaciones mejorar muerte celular mediada por RPW8 de HR-como (erh señalada). Aquí, Divulgamos el aislamiento y caracterización de los mutantes de Arabidopsis erh1, en el que el locus At2g37940 es noqueado por una inserción de T-DNA. Pérdida de la función de ERH1 da lugar a acumulación de ácido salicílico, transcripción mejorada de RPW8 y RPW8-dependiente espontánea HR-como muerte celular en los tejidos de la hoja y disminución de la estatura de la planta. Análisis de la secuencia sugiere que ERH1 puede codificar el homólogo funcional Arabidopsis largamente buscado de levadura y protozoo inositolphosphorylceramide synthase (IPCS), que convierte la ceramida a inositolphosphorylceramide. De hecho, ERH1 es capaz de rescatar al mutante aur1 de levadura, que carece del IPCS, y el mutante de erh1 plantas pantalla reducido (aproximadamente 53% de tipo salvaje) niveles de hoja actividad IPCS, indicando que ERH1 codifica una planta IPCS. De acuerdo con su función bioquímica, la mutación de erh1 causa acumulación de ceramida en plantas que expresan RPW8. Estos datos refuerzan el concepto eso Juegos de esfingolípidos metabolismo (específicamente, acumulación de ceramida) un papel importante en la modulación de planta programada muerte celular asociada a defensa.

Estructura De PqsD, Una Pseudomonas Quinolona Señal Biosintética Enzima, En Complejo Con Antranilato

Biochemistry. Sep, 2009  |  Pubmed ID: 19694421

Señal de Pseudomonas quinolona (PQS), 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone, es una quinolona de alquil intercelular señalización molécula producida por el patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa. Alquilo quinolona señalización es un sistema anormal que, en p. aeruginosa, controla la expresión de numerosos factores de virulencia. PQS es sintetizada de la vía de triptófano intermedia, antranilato, que se deriva la quinurenina vía o desde un alquil quinolona específicos antranilato sintasa codificada por phnAB. Antranilato se convierte en PQS por las enzimas codificadas por el operón pqsABCDE y pqsH. PqsA forma un tioéster activado anthraniloyl-CoA que lleva antranilato al sitio activo de PqsD donde se transfiere a Cys112 de PqsD. En la única reacción bioquímico caracterizada, se produce una condensación luego entre anthraniloyl-PqsD y malonil-CoA o malonil-ACP, un segundo sustrato PqsD, formando 2, 4-dihydroxyquinoline (DHQ). El rol de PqsD en la biosíntesis de otras quinolonas alquil, como PQS, está claro, aunque se ha informado que se requerirán para su producción. No existen evidencias que DHQ es un precursor PQS, sin embargo. Aquí presentamos una caracterización estructural y Biofísica de PqsD que incluye varias estructuras de cristal de la enzima, incluido el del PqsD-antranilato intermedio covalente y el mutante de sitio activo inactivo Cys112Ala en complejo con antranilato. La estructura revela que PqsD es estructuralmente similar a las familias FabH y chalcona de la sintasa de ácidos grasos y Policétido sintasa. La unidad asimétrica cristalográfica contiene un dímero de PqsD. El monómero de PqsD se compone de dos dominios de aproximadamente 170-residuo alphabetaalphabetaalpha casi idéntico. Las estructuras muestran antranilato-liganded Cys112 lleva profundamente colocado en el interior de la proteína en la parte inferior de un aproximadamente 15 un largo canal mientras se espera una segunda molécula de anthraniloyl-CoA en la hendidura a la superficie de la proteína. Cys112, His257 y Asn287 forman la tríada catalítica de FabH como de PqsD. El mutante C112A está inactivo, aunque se vincula aún reversible anthraniloyl-CoA. El complejo covalente entre antranilato y Cys112 claramente ilumina la orientación de los elementos clave de la maquinaria de PqsD catalítica y representa una instantánea de un punto clave en el ciclo catalítico.

Estructura De La Proteína Biosintética ácida D-alanylgriseoluteic EhpF, Un Miembro Atípico De La Superfamilia ANL De Enzimas Adenylating

Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. Jun, 2010  |  Pubmed ID: 20516619

La estructura del EhpF, una proteína de 41 kDa que funciona en la vía biosintética que conduce al ácido D-alanylgriseoluteic compuesto antimicrobiano amplio espectro (AGA), se informó. Un grupo de aproximadamente 16 genes, incluyendo ehpF, localizado en un plásmido de kbp 200 nativos a ciertas cepas de Pantoea agglomerans codifica las proteínas que se requieren para la conversión del ácido corísmico a AGA. METOSULFATO-1,6-dicarboxilato ha sido identificado como un intermediario en la biosíntesis de la AGA y eliminación de resultados ehpF en la acumulación de este compuesto en vivo. Los datos cristalográficos presentados aquí revelan que EhpF es un miembro atípico de la acil-CoA sintasa o Superfamilia ANL de enzimas adenylating. Típicamente, estas enzimas catalizan reacciones de dos etapas que implica la adenylation de un sustrato de carboxilato seguido por transferencia del sustrato del amplificador a la coenzima A u otro fosfopanteteína. EhpF se distingue por la ausencia del dominio c-terminal que es característico de las enzimas de esta familia y está implicado en el enlace de fosfopanteteína y en la segunda mitad de la reacción de dos pasos canónicos que típicamente se observa. Basado en la estructura de EhpF y un análisis bioinformático, se propone que EhpF y EhpG convierten Fenazina-1,6-dicarboxilato a 6-formylphenazine-1-carboxilato vía un adenylyl intermedio.