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Articles by James W. Gallagher in JoVE
JoVE Bioengineering
Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs
1Department of Nanomedicine, The Methodist Hospital Research Institute, 2CAS Key Laboratory for Biological Effects of Nanomaterials & Nanosafety, National Center for Nanoscience and Technology
Nous avons développé une technologie basée sur le film de silice mésoporeuse mince pour la récupération sélective des protéines de faible poids moléculaire et des peptides à partir de sérum humain. Les propriétés physico-chimiques de nos puces mésoporeux ont été finement réglé pour fournir un contrôle substantiel dans l'enrichissement peptide et par conséquent le profil du protéome sérique à des fins diagnostiques.
Other articles by James W. Gallagher on PubMed
Structure and Interfacial Properties of Humaine Apolipoprotéine A-V
L'apolipoprotéine A-V (apoA-V), le dernier-né de la famille d'apolipoprotéine plasma, a été récemment découvert par comparaison de la souris et le génome humain. Des études chez les rongeurs et les enquêtes sur la population du polymorphisme humain apoA-V ont constaté un fort effet d'apoA-V sur les triglycérides plasmatiques. Vers l'élucidation de la fonction biologique de l'apolipoprotéine a-V, nous avons utilisé des techniques de chimie de surface et spectroscopiques pour sonder son activité structure et interfaciale. Analyse de la séquence assistée par ordinateur d'apoA-V prévoit que c'est très hydrophobe, contient une quantité significative d'alpha-hélicoïdale structure secondaire et est probablement composée de discrètes régions structurales avec divers degrés d'affinité de lipides. La spectroscopie de fluorescence de recombinant humain apoA-V mis en évidence un plissement tertiaire, et des études de diffraction de la lumière ont indiqué qu'apoA-V transforme les vésicules dimyristoylphosphatidylcholine discoïdale complexes avec une efficacité similaire à celle de l'apoA-I. Techniques de chimie de surface a révélé qu'apoA-V affiche une affinité élevée, faible élasticité et cinétique de la liaison lente aux interfaces hydrophobes, propriétés, que nous vous proposons peuvent retarder l'assemblage de particules riches en triglycérides. Études métaboliques d'étiquetage et d'immunofluorescence de cellules de COS-1 transfectées avec humaine apoA-V a démontré qu'apoA-V est mal sécrétée, reste associé avec le réticulum endoplasmique et ne pas trafic vers l'appareil de Golgi. Étant donné que la surexpression du gène de l'apolipoprotéine a-V fait baisser les triglycérides plasmatiques chez les souris, ces résultats suggèrent ensemble qu'apoA-V peut fonctionner dans les cellules pour moduler la synthèse hépatique de VLDL et/ou la sécrétion.
ApoA-IV L'étiquette Avec Le Signal De Rétention KDEL ER Perturbe Le Trafic Intracellulaire Et La Sécrétion De L'apoB
Pour examiner le rôle de l'apolipoprotéine A-IV (apoA-IV) dans le trafic intracellulaire et la sécrétion de l'apoB, cellules COS ont été cotransfectés avec protéine de transfert des triglycérides microsomique (MTP), apoB-41 (amino terminal 41 % d'apoB) et native apoA-IV ou apoA-IV modifié avec le signal de rétention carboxy-terminal endoplasmique (ER), KDEL (apoA-IV-KDEL). Comme prévu, apoA-IV-KDEL est inefficacement sécrétée par rapport aux indigène apoA-IV. Coexpression d'apoB-41 avec apoA-IV-KDEL réduit la sécrétion de l'apoB-41 par environ 80 %. L'effet de l'apoA-IV-KDEL est spécifique, comme ni formulaires modifiés KDEL de l'albumine sérique humaine ou apoA-j'ai touché la sécrétion de l'apoB-41. Des résultats similaires ont été observés dans les cellules d'hépatome rat McA-RH7777, qui expriment le PSG endogène. Complet inhibitrice de l'apoA-IV-KDEL sur la sécrétion de l'apoB a été observée uniquement pour les formulaires d'apoB contenant un minimum de 25 % amino-terminale de la protéine (apoB-25). Toutefois, apoA-IV-KDEL inhibe la sécrétion des formes associées aux lipides et la pauvre en lipides d'apoB-25. La microscopie en immunofluorescence deux étiquettes des cellules transfectées avec native apoA-IV et b-25 a révélé que les deux apolipoprotéines ont été localisés dans l'ER et l'appareil de Golgi, comme prévu. Cependant, lorsque l'apoA-IV-KDEL était cotransfected avec apoB-25, les deux protéines localisés principalement à l'ER. Ces données suggèrent qu'apoA-IV peut-être interagir physiquement avec l'apoB dans la voie de sécrétion, ce qui reflète peut-être un rôle dans la modulation du processus d'assemblage des lipoprotéines riches en triglycérides et la sécrétion.
La Surexpression De L'apolipoprotéine A-IV Améliore La Sécrétion De Lipides Dans Les Cellules De L'IPEC-1 En Augmentant La Taille Des Chylomicrons
Apolipoprotéine intestinale expression A-IV est fortement réglementée par des lipides alimentaires chez les porcs nouveau-nés, ce qui suggère un rôle dans l'absorption des lipides. Surexpression constitutive de l'apoA-IV dans les entérocytes de porcs nouveau-nés améliore la sécrétion basolatérale de triacylglycérol (TG) dans les lipoprotéines riches en TG 4,9 (Lu, S., Yao, Y., Meng, S., Cheng, x. et noir, D. D. (2002) J. Biol. Chem. 277, 31929-31937). Pour étudier le mécanisme de cette amélioration, les cellules de l'IPEC-1 ont été transfectées avec un système d'expression tétracycline-réglementable (Tet-On). Dans les cellules incubées avec de l'acide oléique, une relation dose-effet a été observée entre la concentration moyenne de doxycycline et basolatérale apoA-IV et la sécrétion de TG. Réglementés de même l'expression de l'apoA-I n'ont pas stimulé la sécrétion lipidique. Le diamètre moyen des lipoprotéines riches en TG sécrétée par les cellules traitées doxycycline était supérieur de cellules non traitées (87,0 nm contre 53,4 nm). Sécrétion d'apoB basolatérales diminue. Utilisant le même système d'expression, pleine longueur humaine apoA-IV (376 amino-acides) ; un « porc-like » humain apoA-IV, manque le EQQQ C-terminal répète (361 aminoacides) ; et un « poulet-like » apoA-IV, outre tronqué à 343 acides aminés, ont été exprimés dans les cellules de l'IPEC-1. Avec l'augmentation de la sécrétion de protéines, cellules exprimant l'apoA-IV humaine pleine longueur a affiché une augmentation de 2 fois dans la sécrétion de TG. bien au contraire les cellules exprimant le porc comme humain apoA-IV affichent 25 fois une augmentation de sécrétion de la TG et étant une augmentation de diamètre de lipoprotéines. Lorsque les humain apoA-IV a été tronquée davantage pour produire une protéine poulet, sécrétion de TG est inhibée. Nous concluons que la surexpression de l'espèce porcine apoA-IV améliore la sécrétion basolatérale TG de manière dose-dépendante en augmentant la taille des lipoprotéines sécrétées. Ces données suggèrent que la région de la protéine humaine apoA-IV de résidus 344 à 354 est essentielle à sa capacité à améliorer la sécrétion lipidique, peut-être en permettant le conditionnement de base supplémentaire TG en particules de chylomicrons. La région riche en EQQQ jouerait un rôle inhibiteur ou modulateur en emballage de chylomicrons chez l'homme.
Activation De La Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 Est Nécessaire Et Suffisant Pour Stimuler Les Eucaryotes Initiation Factor 2Bvarepsilon ARNm Traduction Et La Synthèse Des Protéines
Dans une étude précédente, nous avons démontré une exigence pour l'activation de mTORC1 dans la stimulation de la traduction d'ARNm eIF2Bepsilon dans le muscle squelettique en réponse à l'exercice de musculation. Bien que cette étude a établi la nécessité d'activation de mTORC1, le modèle expérimental utilisé ne se prêtait pas facilement pour répondre à la question de savoir si mTORC1 activation était suffisante pour produire la réponse. Par conséquent, la présente étude visait à remédier au caractère suffisant de l'activation de mTORC1, avec des cultures de fibroblastes Rat2 dans lequel mTORC1 de signalisation a été réprimée par le sérum/leucine-appauvrissement de la couche et stimulée par la réplétion de leucine et/ou d'IGF-1. Réplétion avec la leucine et d'IGF-1 provoque un déplacement du mRNA eIF2Bepsilon en traduisant activement les polysomes et une stimulation de la synthèse des protéines eIF2Bepsilon nouveau, mais il n'avait aucun effet sur l'ARNm codant pour les quatre autres sous-unités eIF2B. Stimulation de la traduction d'eIF2Bepsilon a été infirmée par le prétraitement avec l'inhibiteur de mTORC1 la rapamycine. Surexpression exogène de drapeau-Rheb, un activateur proximal de mTORC1, a également provoqué une redistribution des eIF2Bepsilon ARNm en polysomes et une stimulation de la synthèse des protéines eIF2Bepsilon. La stimulation de la traduction des ARNm eIF2Bepsilon a eu lieu en l'absence de tout effet sur l'abondance des ARNm eIF2Bepsilon. Précipitation véhiculée par Arni d'eIF2Bepsilon a donné lieu à une prolifération cellulaire réduite, un résultat que phénocopie l'effet cytostatique connu de répression mTORC1. Dans l'ensemble, les résultats démontrent que l'activation de mTORC1 est nécessaire et suffisant pour stimuler la traduction des ARNm eIF2Bepsilon et que cette réponse peut représenter un nouveau mécanisme par lequel mTORC1 peut influer sur les taux de croissance/prolifération cellulaire et la synthèse des protéines, initiation de la traduction ARNm.
Réduite D'initiation Eucaryote Facteur 2Bepsilon Sous-unité Expression Supprime Le Phénotype Transformé Des Cellules Surexprimant La Protéine
Eucaryotes initiation factor 2 b (eIF2B), un facteur d'échange de nucléotide de guanine cinq sous-unités, joue un rôle clé dans la régulation de la traduction de l'ARNm. Expression de la sous-unité epsilon est régulée spécifiquement dans certaines conditions associées à la croissance cellulaire accrue. Par conséquent, le but de cette étude était d'examiner l'effet de réprimer l'expression de l'eIF2Bepsilon sur les taux de croissance, la synthèse des protéines et d'autres caractéristiques des deux lignées de cellules tumorigènes affichent expression régulée de la sous-unité epsilon. Expériences visaient à comparer des fibroblastes spontanément transformés aux fibroblastes embryonnaires de souris transformées infectées par un lentivirus contenant une épingle à cheveux court RNA dirigé contre eIF2Bepsilon. Les cellules exprimant l'épingle courte RNA affichent une réduction dans l'abondance d'eIF2Bepsilon à 30 % de la valeur observée dans les fibroblastes embryonnaires de souris transformées non infectées, sans changement dans l'expression de le quelconque des quatre autres sous-unités. La répression de l'expression d'eIF2Bepsilon s'est accompagnée de réductions dans l'activité du facteur guanine nucleotide exchange et un taux global de la synthèse protéique. En outre, expression réprimée eIF2Bepsilon conduit à des réductions marquées dans les taux de croissance de cellules en culture, la formation de colonies dans la gélose molle et la progression tumorale chez la souris nude. Des résultats similaires ont été obtenus dans les cellules MCF-7 maternel du cancer dans laquelle eIF2Bepsilon expression est réprimée par transfection transitoire avec un petit ARN interférent dirigé contre la sous-unité epsilon. Dans l'ensemble, les résultats supportent un rôle d'eIF2Bepsilon dans la régulation de la croissance cellulaire et suggèrent qu'il peut représenter une cible thérapeutique pour le traitement du cancer chez l'homme.
ApoA-IV Module Le Trafic Sécrétrices D'apoB Et La Taille Des Lipoprotéines Riches En Triglycérides
Bien que la preuve liant l'expression de l'apoA-IV et les triglycérides (TG)-Assemblée de lipoprotéines riches et de la sécrétion est convaincante, les mécanismes intracellulaires, par lequel l'apoA-IV pourrait moduler ces processus restent mal compris. Nous avons donc examiné l'impact fonctionnel d'expression apoA-IV sur l'apoB endogène, TG, et la sécrétion des VLDL en transfectées stablement McA-RH7777 cellules d'hépatome de rat. Expression de l'apoA-IV modifié avec le signal de rétention du réticulum endoplasmique (re) KDEL (apoA-IV-KDEL) considérablement diminué aussi bien le taux et l'efficacité de la sécrétion endogène d'apoB, suggérant une interaction pré-sécrétoires apoA-IV-KDEL et apoB ou lipoprotéines contenant l'apoB. Expression de native apoA-IV en utilisant soit un promoteur constitutif ou tétracycline-inducible retardé la vitesse initiale de la sécrétion de l'apoB et réduit l'efficacité de la finale de la sécrétion de ∼40 %. Cependant, tandis qu'apoA-IV-KDEL réduit la sécrétion de la TG de 75 %, expression de native apoA-IV causé une augmentation de 20 à 35 % la sécrétion de TG, accompagnée d'une augmentation de % ∼55 apoB associées aux VLDL, une augmentation du ratio de TG:phospholipid des lipoprotéines sécrétées d < 1.006 et une augmentation de 10,1 nm de diamètre de particules VLDL(1) PIC. Expression Native apoA-IV a eu un impact négligeable sur l'expression du gène MTP. Ces données suggèrent que, en interagissant avec l'apoB dans la voie de sécrétion, apoA-IV modifie la cinétique traite de l'apoB contenant des lipoprotéines riches en TG à travers des compartiments cellulaires lipidation, qui à son tour, améliore la dilatation de la particule et augmente la sécrétion de TG.
