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Articles by Kai C Sonntag in JoVE
JoVE General
ES Cell-derivati colture cellulari neuroepiteliale
McLean Hospital, Harvard Medical School
Derivazione di precursori neuroepiteliale da staminali embrionali (ES), le cellule stromali utilizzando cellule derivate attività induttiva (SDIA).
Other articles by Kai C Sonntag on PubMed
Analisi Dei Sistemi Differenti Del Promotore Per L'espressione Del Transgene Efficiente in Linee Di Cellule Staminali Embrionali Di Topo
Le cellule staminali embrionali (ES) del mouse sono derivate dalla massa interna delle cellule dell'embrione preimpianto e hanno la capacità di sviluppo per generare tutti i tipi di cellule del corpo. Combinato con efficiente manipolazione genetica e delle procedure di differenziazione in vitro, le cellule ES sono un sistema utile per l'analisi molecolare dei percorsi di sviluppo. Abbiamo analizzato e confrontato l'attività trascrizionale di un cellulare polipeptide catena allungamento fattore 1 alfa (EF), un ibrido cellulare-virus (cytomegalo-virus [CMV] immediato inizio enhancer fusi di pollo beta-actina [CBA]) e un sistema di promotore CMV virale in due linee di cellule ES. Quando transitoriamente transfected, i promotori EF e CBA guidato robustamente espressione del gene reporter, mentre il promotore CMV è stato inattivo. Abbiamo anche dimostrato che i promotori EF e CBA ha guidato in modo efficace espressione genica in diversi stadi di sviluppo delle cellule: naïve ES, corpi embryoid (EBs) e cellule precursori neuronali. Al contrario, il promotore CMV non hanno attività trascrizionale in cellule ES o EB ma aveva un'attività significativa una volta che le cellule ES differenziano in precursori neuronali. I nostri dati mostrano che singoli promotori hanno abilità differenti di esprimere l'espressione del gene reporter nell'ES e altri tipi di cellule testati.
Ingegneria Genetica Delle Cellule Staminali Embrionali Di Topo Da Nurr1 Aumenta La Differenziazione E Maturazione in Neuroni Dopaminergici
Nurr1 è un fattore di trascrizione critico per lo sviluppo dei neuroni dopaminergici (DA) mesencefalo. Questo studio modificato le cellule staminali embrionali (ES) del mouse di esprimere costitutivamente Nurr1 sotto il promotore del fattore-1alpha allungamento. L'espressione in cellule ES Nurr1 portare alla up-regolazione di tutti i marker neuronale DA testato, risultanti un aumento di 4 a 5 volte la percentuale di neuroni DA. In contrasto, altri marcatori neuronali e gliali non sono stati cambiati in modo significativo dall'espressione Nurr1. È stato anche osservato che c'è stato un ulteriore incremento di 4 volte il numero di neuroni DA cloni che esprimono Nurr1 dopo il trattamento con Shh, FGF8 e acido ascorbico. Parecchie linee di prova suggeriscono che questi neuroni possono rappresentare fenotipi neuronale mesencefalo DA; in primo luogo, essi coesprimere marcatori mesencefalo DA come decarbossilasi acida L-aminoacidi aromatici, calretinina e trasportatore della dopamina, in aggiunta alla tirosina idrossilasi e in secondo luogo, essi non coesprimere altri neurotrasmettitori quali GABA o serotonina. Infine, coerente con un aumento del numero di neuroni DA, la trasduzione Nurr1 migliorato la capacità di questi neuroni a produrre e rilasciare DA in risposta alla depolarizzazione della membrana. Questo studio dimostra un'efficiente manipolazione genetica delle cellule di ES che facilita la differenziazione di neuroni DA mesencefalo, e servirà come un quadro di ingegneria genetica delle cellule di ES da fattore di trascrizione chiave per regolare il loro destino di cella.
Specifici MicroRNA Modula La Neurogenesi Derivato Da Cellule Staminali Embrionale
MicroRNA (miRNAs) è recentemente scoperte piccole non codificanti trascrizioni con un ampio spettro di funzioni descritte soprattutto negli invertebrati. Come espresione regolatori dell'espressione genica, miRNAs innescare la degradazione di mRNA bersaglio o repressione traslazionale. Anche se centinaia di miRNAs è stato clonato da una varietà di mammiferi tessuti e cellule e più destinazioni di mRNA sono stati stimati, piccolo è conosciuti circa le loro funzioni. Finora, un ruolo di miRNA è stata descritta solo ematopoietiche, adipocytic e la differenziazione del muscolo; regolazione della secrezione di insulina; e potenzialmente regolazione della crescita del cancro. Qui, descriviamo miRNA expression profiling in mouse staminali embrionali (ES) cellula-derivato neurogenesi in vitro e mostrano che un certo numero di miRNAs è simultaneamente co-induced durante la differenziazione delle cellule progenitrici neurali di neuroni e astrociti. C'era una chiara correlazione tra profili di espressione di miRNA nella neurogenesi cellule derivate ES in vitro e nella neurogenesi embrionale in vivo. Utilizzando approcci sia funzione di guadagno e perdita di funzione, dimostreremo che cervello-specifico del miR-124a e miR-9 molecole possono influenzare differenziazione neurale lignaggio nelle colture di cellule derivate ES. Inoltre, forniamo prove che trasduttore di segnale e attivatore di trascrizione (STAT) 3, un membro della famiglia via STAT, è coinvolto nella funzione di questi miRNAs. Concludiamo che distinti miRNAs svolgono un ruolo funzionale nella determinazione delle Parche neurale nel differenziamento cellulare ES.
Transitoria Espressione Recettore Della Dopamina D1 I Neuroni Di Proiezione Corteccia Prefrontale: Rapporto a Una Maggiore Salienza Motivazionale Di Droga Spunti Nell'adolescenza
L'adolescenza è un periodo transitorio durante lo sviluppo che è associato con un rischio maggiore di dipendenza da droghe rispetto a qualsiasi altra età. Nella corteccia prefrontale (PFC), d (1) ricevitori della dopamina mediano attribuzione di rilevanza motivazionale, che gioca un ruolo nella dipendenza. Qui, abbiamo studiato la relazione tra età-correlate dell'espressione dei recettori della dopamina d (1) nel PFC con la maturazione della cocaina posto condizionata. Microscopia confocale ha rivelato che i neuroni di output corticale retrogradely tracciata al nucleus accumbens esprimono livelli più elevati di recettori d (1) durante l'adolescenza rispetto ai più giovani e più anziani di età. D (1) espressione non cambia sul GABAergic interneurons in età. Adolescente differenze nell'espressione d (1) si verificano indipendentemente dalla connettività corticale accumbens, che prolifera attraverso l'età adulta. Comportamentale, ratti adolescenti sono più sensibili al posto di cocaina condizionata rispetto a ratti giovani e anziani. Tuttavia, microiniezioni di antagonista d (1) SCH23390 nel PFC bloccato adolescente posto preferenze, mentre microiniezioni di d (1) agonisti dose-dipendente aumentato le preferenze per gli ambienti di cocaina-associati in precedenza non preferiti dai giovani. Questi risultati suggeriscono che la maggiore espressione dei recettori d (1) sulla corticale accumbens proiezioni può aiutare a spiegare maggiore sensibilità agli eventi ambientali e comportamenti di dipendenza durante l'adolescenza, mentre la scarsità di D (1)-esprimendo le proiezioni può ridurre il rischio nei giovani.
Giovanile Metilfenidato Modula Comportamenti Correlati Ricompensa E Flusso Sanguigno Cerebrale Diminuendo I Recettori D3 Corticali
Disordine di iperattività di deficit di attenzione è associato con il flusso di sangue ridotto corticale che è reversibile con l'esposizione per i psicostimolanti metilfenidato (MPH). I recettori della dopamina D3 modulano stimolante-indotto cambiamenti nel flusso sanguigno e sono associati con ricompensa di elaborazione durante l'età adulta giovane, ma il loro ruolo negli effetti duraturi di MPH durante lo sviluppo è sconosciuto. Ratti sono stati dati veicolo (VEH) o MPH (2 mg/kg tra postnatale giorni 20-35) e valutati in giovane età adulta per il volume ematico cerebrale regionale (rCBV) dopo la sfida MPH e mRNA i livelli di espressione dei recettori della dopamina. Coinvolgimento dei recettori D3 della sonda, soggetti minorenni sono stati esposti a VEH, MPH, l'agonista preferendo D3 + /-7-OHDPAT (0,3 mg/kg), il nafadotride di antagonista D3 (Naf; 0.05, 0,5 o 5,0 mg/kg) o un Naf (0,05 mg/kg) / combinazione MPH e valutato biochimicamente e comportamentale. Giovanile MPH esposizione aumentata rCBV MPH-indotta nella corteccia prefrontale mediale e cingolata e talamo in età adulta. Comportamentale, giovanile MPH - o + /-7-OHDPAT-esposti soggetti hanno dimostrato un'avversione per ambienti associati di cocaina, che è stata impedita da giovanile co-treatment con MPH e Naf, o con adulti corticale microiniezioni di + /-7-OHDPAT. Livelli di mRNA di D3 corticale significativamente diminuito del 23,8 + 6,7% nei soggetti trattati con MPH e normalizzati con trattamento combinato di Naf/MPH, con nessun cambiamento in altri recettori della dopamina. Attraverso una riduzione dei recettori D3, che a sua volta riduce il comportamento di ricerca di droga può verificarsi una maggiore reattività corticale di psicostimolanti. Questi dati forniscono la prova per un periodo postnatale sensibile quando l'esposizione MPH giovanile è in grado di alterare lo sviluppo corticale.
I Neuroni Della Dopamina Da Cellule Staminali Embrionali Primate Ristabilire La Funzione in Sperimentale Della Malattia Di Parkinson
L'identità e il potenziale funzionale dei neuroni della dopamina derivate in vitro di cellule staminali embrionali sono fondamentali per lo sviluppo di una terapia di sostituzione basato su cellule staminali per la malattia di Parkinson. Utilizzando una linea di cellule staminali embrionali nei primati, noi abbiamo generato i neuroni della dopamina che visualizzano persistente espressione mesencefalo regionale e cella specifici fattori di trascrizione, che stabilire la loro identità corretta e consentire per la loro sopravvivenza. Mostriamo qui che il trapianto di neuroni della dopamina nei Ripristina funzione motore di hemi-parkinsoniano, ratti 6-idrossi-dopamina-elettivamente. L'esposizione a fattori di crescita Wnt5a e dei fibroblasti (FGF) 20 e 2 nella fase finale della differenziazione in vitro migliorato la sopravvivenza dei neuroni della dopamina e, corrispondentemente, nella misura di recupero motore di animali trapiantati. Importante per il futuro sviluppo di applicazioni cliniche, i neuroni della dopamina sono stati post-mitotic al momento del trapianto e non non c'era nessuna formazione di tumore. Questi dati forniscono la prova per il concetto che le cellule staminali nei sono una fonte adeguata di neuroni funzionali per applicazioni terapeutiche.
Profilo Di Espressione Genica Dei Neuroni Della Dopamina Substantia Nigra: Ulteriori Approfondimenti in Patologia Di Parkinson
Malattia di Parkinson è causata da una progressiva perdita di neuroni della dopamina (DA) mesencefalo la substantia nigra pars compacta. Sebbene la causa principale della malattia di Parkinson rimane sconosciuta, c'è crescente evidenza che è una malattia complessa causata da una combinazione di fattori genetici e ambientali, che influenzano la chiave segnalazione percorsi nella substantia nigra DA neuroni. Intuizioni nella patogenesi della malattia di Parkinson derivano da modelli in vitro e in vivo e da analisi post-mortem. Recenti sviluppi tecnologici hanno aggiunto una nuova dimensione di questa ricerca mediante la determinazione di profili di espressione genica mediante analisi di microarray ad alto rendimento. Tuttavia, molti studi riportati fino ad oggi erano basati su dissezioni intero mesencefalo, che comprendeva le cellule diverso DA neuroni. Qui, abbiamo utilizzato microdissection laser per isolare il singoli DA neuroni dalla substantia nigra pars compacta di controlli e soggetti con idiopatica della malattia di Parkinson abbinati per età e post-mortem interval seguita da microarray per analizzare il profilo di espressione genica. I nostri dati confermano una disregolazione dei diversi gruppi funzionali di geni coinvolti nella patogenesi della malattia di Parkinson. In particolare, abbiamo trovato prominente down-regulation dei membri della famiglia genica PARK e disregolazione di geni multipli associati a morte programmata delle cellule e la sopravvivenza. Inoltre, geni per recettori canale neurotrasmettitore e ioni erano anche deregolamentati, sostenendo la vista che alterazioni nell'attività elettrica potrebbero influenzare la funzione del neurone DA. I nostri dati forniscono un 'identità molecolare delle impronte digitali' di neuroni fase tardiva DA morbo di Parkinson che farà avanzare la nostra comprensione della patologia molecolare di questa malattia.
Prove Per Profili Transcriptional Genere-specifici Dei Neuroni Della Dopamina Nigral Nella Malattia Di Parkinson
Dati epidemiologici suggeriscono che il genere maschile è uno dei fattori di rischio per lo sviluppo della malattia di Parkinson (PD). Inoltre, le differenze nella manifestazione clinica e il corso del PD sono state osservate tra maschi e femmine. Tuttavia, poco si sa circa gli aspetti molecolari sottostanti la specificità di genere nel PD. Per risolvere questo problema, abbiamo determinato i profili di espressione genica dei neuroni maschili e femminili della dopamina (DA) nel PD sporadici.
Un Romanzo, Più Modello Sintomo Di Comportamenti Simil-obsessive-compulsive Negli Animali
Attuali modelli animali di disturbo ossessivo-compulsivo (OCD) coinvolgono tipicamente provocazione sintomo acuto, farmaco-indotta o un'associazione genetica con stereotipie o ansia. Nessuno di questi modelli attuali dimostrano più comportamenti OCD-like.
Neuronale Tipo Specifico Gene Espressione Profilatura E Laser Capture Microdissection
Il cervello umano è una struttura estremamente eterogenea. Al fine di comprendere in base neurobiologica di dispersioni circuito neurale in varie malattie neurologiche o psichiatriche, è spesso importante definire le cascate molecolari che sono associate con questi disturbi in modo specifico del tipo neuronale. Ciò può essere ottenuto mediante l'uso di laser microdissection, in combinazione con tecniche molecolari come gene expression profiling. Per identificare i neuroni nel tessuto cerebrale umano post-mortem, uno può usare le proprietà intrinseche del neurone, come la pigmentazione e la morfologia o la sua composizione strutturale attraverso l'immunoistochimica (IHC). Qui, descriviamo l'isolamento di cellule neuronali omogenee e di alta qualità RNA dal materiale umano cervello post-mortem, utilizzando una combinazione di IHC rapida, Nissl colorazione, o semplice morfologia con Laser Capture Microdissection (LCM) o Laser Microdissection (LMD).
MiRNA Convergente Funzioni Nel Cervello Diversi Disturbi: Un Caso Per MiR-124 E MiR-126
Un crescente corpo di informazioni sulla biologia dei miRNAs ha rivelato la nuova visione nei loro ruoli di omeostasi normale e patologia della malattia. miRNAs controllare tutti i passaggi del macchinario cellulare espressione agendo attraverso un "singolo miRNA/multipli bersagli" o "multiple miRNAs singolo bersaglio" meccanismo. Hanno un profondo impatto sulla regolazione del signaling pathways, che regolano le funzioni comuni e specifiche attraverso diversi fenotipi cellulari. C'è crescente evidenza che le varie malattie condividono simili disturbi nelle reti di espressione genica. Poiché miRNAs hanno effetti diversi e comuni in contesti diversi cellulari, potrebbe anche influenzare sovrapposti signaling pathways in diversi organi ed entità di malattia. Qui, passiamo in rassegna questo concetto per due miRNAs molto abbondante nel cervello, miR-124 e miR-126 e il loro potenziale ruolo nelle malattie del cervello.
Rilevamento Di Intranasale Consegnate Derivate Da Midollo Osseo Mesenchymal Cellule Stromali Del Cervello Del Mouse Elettivamente: Un Rapporto Cauzionale
Derivate da midollo osseo stromale cellule mesenchimali (MSCs) promettono per il trattamento di trapianto autologo di neuropathologies. Consegna intranasale è relativamente non invasiva e recentemente è stato segnalato per causare trasporto di MSCs al cervello. Tuttavia, la capacità di MSCs migrare da passaggi nasali per siti di neuropatologia e sopravvivere in definitiva non è stata completamente esaminata. In questo libro, abbiamo raccolto MSCs da topi transgenici esprimere la proteina fluorescente verde migliorata (cellule appresso MSC-EGFP) e consegnato loro intranasale di topi wild-type, sostenere le lesioni meccaniche nello striato. Usando fluorescente, colorimetrici e metodi di individuazione ultrastrutturali, le cellule che esprimono GFP erano rilevabili nel cervello da 3 ore per 2 mesi dopo la consegna MSC. Tuttavia, brillante autofluorescenza che somigliava fortemente emissione da GFP è stato osservato nel bulbo olfattivo e striato di controllo elettivamente e topi MSC-EGFP-trattati. In un esperimento di controllo, abbiamo impiantato MSC-EGFPs nello striato del mouse direttamente e rilevato robusti GFP expression 1 e 7 giorni dopo l'impianto. Questi risultati suggeriscono che-sotto il nostro conditions-intranasally consegnati MSC-EGFPs non sopravvivere o migrare nel cervello. Inoltre, le nostre osservazioni evidenziano la necessità di includere controlli appropriati quando si lavora con GFP come marcatore cellulare.
