Translate this page to:
Italian
In JoVE (1)
Other Publications (7)
Automatic Translation
This translation into Italian was automatically generated.
English Version | Other Languages
Articles by Luis Ugozzoli in JoVE
JoVE General
La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione
Gene Expression Division, Bio-Rad Laboratories, Inc
Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed รจ seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.
Other articles by Luis Ugozzoli on PubMed
Fluorescente Multicolore Multiplex Omogeneo Test Per L'analisi Simultanea Delle Due Più Comuni Mutazioni Emocromatosi
Riportiamo lo sviluppo di un fluorescente multiplex omogeneo dosaggio qualitativo progettato per la rilevazione delle due mutazioni emocromatosi più comuni utilizzando sonde fluorescenti dual-contrassegnate. Il dosaggio è in grado di rilevare quattro varianti alleliche in un unico tubo chiuso utilizzando un protocollo unico thermocycling. La procedura combina la grande sensibilità di reazione a catena della polimerasi, la specificità fornita tramite l'ibridazione allele-specific oligonucleotide utilizzando il formato di dosaggio nucleasi 5(') e la velocità superiore di una procedura di rilevazione di fluorescenza multicolore. DNA genomico è stato preparato da campioni di sangue intero utilizzando le procedure standard. Preparazione del campione di DNA, a seguito di due regioni del gene dell'emocromatosi (HFE) tra cui le mutazioni H63D e C282Y erano coamplified e rilevati tempo reale da quattro differenti fluorescente etichettati sonde del oligonucleotide allele-specifico. Specificità del test è stato dimostrato da uno studio di confronto metodi cieco che comprendeva 37 campioni di DNA da individui con un genotipo HFE noto. Risultati dallo studio ha mostrato che il multicolor dosaggio multiplex HFE classificati inequivocabilmente tutti i genotipi possibili per il gene HFE C282Y e H63D mutations(1). Questa tecnica sarà utile per la ricerca e laboratori di diagnostiche molecolare e può essere facilmente adattata per la rilevazione di altri polimorfismi a singolo nucleotide.
Collegato Amplificazione Lineare Per Analisi Simultanea Delle Due Più Comuni Mutazioni Emocromatosi
Due mutazioni HFE, G845A (aminoacido sostituzione C282Y) e C187G (H63D), sono associati con emocromatosi ereditaria. Abbiamo sviluppato e validato un metodo romanzo, amplificazione lineare collegati (LLA), per la rilevazione di queste due mutazioni.
Genotipizzazione in Tempo Reale Con Oligonucleotide Sonde Contenenti Acidi Nucleici Bloccati
Le sonde del oligonucleotide contenente acido nucleico locked (LNA) ibridano alle sequenze del DNA bersaglio singolo filamento complementare con un'affinità maggiore rispetto al DNA sonde del oligonucleotide. Come conseguenza l'incorporazione dei residui di LNA nella sequenza del oligonucleotide, la temperatura di fusione del oligonucleotide aumenta notevolmente, permettendo così l'uso riuscito di sonde LNA più brevi come strumenti di allele-specific in dosaggi di genotipizzazione. In questo articolo, segnaliamo l'uso di sonde contenenti residui LNA per lo sviluppo qualitativo dosaggi multiplex fluorescenti per l'individuazione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) in reazione a catena della polimerasi in tempo reale utilizzando la 5'-test di rilevamento della nucleasi. Abbiamo sviluppato due applicazioni che mostrano la migliore specificità delle sonde LNA in dosaggi per discriminazione allelica. La prima applicazione è una quadricromia 5'-saggio di nucleasi per la rilevazione di SNP per due dei più comuni fattori genetici coinvolti nel rischio trombotico, fattore V di Leiden e protrombina G20210A. La seconda applicazione è un saggio di due colori per il rilevamento specifico della tranversion A-a-T nel codone 6 del gene della beta-globina, responsabile dell'anemia falciforme. Sia in tempo reale genotyping assays sono stati valutati confrontando le prestazioni del nostro metodo e quella di un metodo di riferimento e in entrambi i casi, abbiamo trovato una concordanza del 100%. Questo approccio sarà utile per la ricerca e laboratori di diagnostiche molecolare in situazioni in cui la specificità fornita dal DNA sonde del oligonucleotide è insufficiente per discriminare tra due sequenze di DNA che differiscono per un solo nucleotide.
Quadricromia Multiplex 5' Nucleasi Test Per La Rilevazione Simultanea Del Fattore V Di Leiden E Le Mutazioni G20210A Protrombina
Abbiamo sviluppato un'analisi in tempo reale di quadricromia multiplex per la rilevazione simultanea del fattore V Leiden (FVL) e mutazioni G20210A protrombina (PT) in una provetta chiusa utilizzando un protocollo unico thermocycling. Il dosaggio combina la potenza di PCR multiplex con la specificità fornita tramite l'ibridazione allele-specific oligonucleotide (ASO) nel formato 5' nucleasi dosaggio. DNA genomic umano è preparato da sangue intero con le procedure standard. Una sequenza di DNA 97-bp del gene V fattore della coagulazione è co-amplified con una sequenza di DNA-111-bp del gene della coagulazione fattore II (PT) con quattro iniettori PCR. Inoltre, le reazioni comprendeva quattro differenzialmente etichettate ASO sonde per la rilevazione di specifica dei diversi genotipi G20210A FVL/PT. Per valutare le caratteristiche di prestazioni del dosaggio, abbiamo effettuato un confronto dei due metodi. Abbiamo analizzato i campioni di DNA da 52 individui con genotipi FVL/PT G20210A noti che sono stati precedentemente genotipizzati con un'analisi che combinati PCR con l'uso di polimorfismi di restrizione frammento lunghezza. Abbiamo trovato una 100% di concordanza tra i risultati generati dalle due metodologie. Concludiamo l'analisi multiplex quadricromia è specifica e riproducibile per la rilevazione delle mutazioni G20210A FVL/PT, che può essere facilmente adattato per la rilevazione di altri SNPs.
Multiplex Dosaggi Con Lettura Microperlina Fluorescente: Un Potente Strumento Per La Rilevazione Di Mutazione
Quadricromia Trascrizione D'inversione Multiplex PCR - Superare I Suoi Limiti
Trascrizione d'inversione quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) condotta in tempo reale è un potente strumento per la misurazione dei livelli di RNA messaggero (mRNA) in campioni biologici. Multiplex PCR è definito come l'amplificazione simultanea di due o più destinazioni di DNA (cDNA) in un recipiente di reazione singola e può essere effettuata solo utilizzando sonde etichettate in modo univoco per ogni destinazione. Fino a quattro geni possono essere rilevati in un multiplex 5' nucleasi dosaggio quando si utilizza lo strumento adatto e la giusta combinazione di fluorofori. Uno dei vantaggi più importanti di multiplexing è un requisito del campione ridotto, che è particolarmente importante quando il materiale campione scarseggia. Ulteriori vantaggi sono risparmio di tempo sull'installazione di reazione e un costo inferiore rispetto alle reazioni di singleplex. Sebbene multiplexing presenta parecchi vantaggi sopra singleplex qRT-PCR, limitato lavoro è stato fatto per dimostrare la fattibilità. Sono state segnalate alcune pubblicazioni su quadricromia qRT-PCR multiplex, e a nostra conoscenza, nessun lavoro è stato fatto per esplorare i limiti del dosaggio. In questa carta, segnaliamo la prima analisi approfondita di quattro-gene qRT-PCR multiplex. Per ottenere una migliore comprensione dei potenziali limiti del dosaggio qRT-PCR, abbiamo utilizzato in vitro RNA trascritto derivato da quattro geni umani. Per emulare gli esperimenti di espressione genica, abbiamo sviluppato un sistema di modello in cui le trascrizioni in vitro sono stata diluite con RNA totale impianto. Questo modello ci ha permesso di sviluppare un sistema artificiale molto somiglianti a livelli di espressione genica differenziale variabile piega fino a 1 milione. Abbiamo identificato una condizione singola reazione "universale" che ha permesso di amplificazione ottimale in tempo reale dei quattro geni sopra una vasta gamma di concentrazioni di modello. Questo studio dimostra che la multiplazione è un approccio fattibile applicabile alla maggior parte dei dosaggi di qRT-PCR eseguite con RNA totale, indipendente dei livelli di espressione dei geni sotto esame.
Ottimizzazione Delle Condizioni Di Elettroporazione in Primaria E Altre Cellule Difficili a Transfect
Elettroporazione è uno strumento prezioso per la consegna dell'acido nucleico, perché può essere utilizzato per un'ampia varietà di tipi di cellule. Molti scienziati si stanno spostando verso l'uso di tipi di cellule che sono più rilevanti per le applicazioni in vivo, comprese le cellule primarie, che sono considerate difficili a transfect. La capacità di electroporate questi tipi di cellule con molecole di acido nucleico di interesse ad una relativamente alta efficienza mantenendo attuabilità delle cellule è essenziale per chiarire le vie biochimiche in cui è coinvolto un prodotto del gene. Vi presentiamo i dati che dimostrano che, grazie all'ottimizzazione dei parametri di elettroporazione, molecole di acido nucleico possono essere consegnati in un modo altamente efficiente. Visualizziamo i risultati di transfezione per tipi di cellule primarie e difficili a transfect fibroblasti primari umani, cellule endoteliali di vena ombelicale umana, le cellule Jurkat e due linee di neuroblastoma cellule [SK-N-SH (umano) e Neuro-2A (mouse)] con il plasmide DNAs e siRNA. I nostri dati dimostrano che determinando condizioni di elettroporazione corretta, deidrogenasi di fosfato della gliceraldeide che mRNA è stato messo a tacere in Jurkat cells quando rispetto al controllo negativo siRNA elettroporazioni fin dal post-transfection 4 h. Altri esperimenti dimostrano che condizioni di elettroporazione ottimizzato utilizzando un siRNA controllo transfezione fluorescente contrassegnati nel 75% di efficienza di trasfezione per Neuro-2A, 93% per i fibroblasti umani primari e 94% di cellule HUVEC, come analizzato tramite flusso cytometry.
