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Articles by Marijo Kent-First in JoVE
JoVE General
El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal
La capacidad de las células germinales embrionarias a diferenciarse en células germinales primordiales durante etapas tempranas del desarrollo es un modelo perfecto para hacer frente a nuestra hipótesis sobre el cáncer y la infertilidad. Este protocolo se muestra la forma de aislar las células germinales primordiales de las gónadas en desarrollo de embriones de 10.5 a 11.5 días después de ratón coitum.
Other articles by Marijo Kent-First on PubMed
Y Evaluación De Los Cromosomas Y Sus Implicaciones Para El Desarrollo De Los Niños De ICSI
La etiología de la espermatogénesis en peligro a menudo es de naturaleza genética. Hay sólo unos pocos informes de cohortes de padre / hijo que han sido evaluados para determinar la heredabilidad de las mutaciones asociadas con la infertilidad por factor masculino y el bienestar psicológico de los niños. En el presente estudio, múltiples tejidos se tomaron muestras de pacientes del sexo masculino y el consentimiento de sus hijos derivados de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y se sometió a análisis cromosómicos y genéticos. Exámenes pediátricos y psicológicos se llevaron a cabo también. En 87 hombres y los niños 47, 22 secuencias de lugares etiquetados (STS) fueron analizados por PCR múltiple y puntos de ruptura de eliminación se define con loci adicionales. En un paciente, los puntos de interrupción se asignan a la gran inestabilidad palíndromo región rica en AZFc AZFb y proximal se investigó. Un total de 86 sangre, el semen 26, y 73 muestras de células de la mejilla se obtuvieron de los adultos, y 36 muestras de sangre y 44 muestras de células se obtuvieron de las mejillas de los niños. A pesar de todos los padres que tenían cariotipo normal, la incidencia de anomalías cromosómicas en las células somáticas de los hijos varones fue del 8,3% (3/36). La incidencia de aneuploidía en la línea germinal en estos hombres era 0,5-2,8%. Una mutación de FQ (Delta508) se detectó en uno de los 87 hombres (1,2%) y microdeleciones en Yq AZF se detectaron en el 3,4% de 87 adultos y en el 2,1% de sus hijos (n = 47). En conclusión, la detección de microdeleciones del cromosoma Y contiene información crucial en la orientación de las parejas que buscan tratamiento para la infertilidad. Por otra parte, la extracción de ADN y las evaluaciones Y la supresión de células de la mejilla proporcionar un enfoque no invasivo. La herencia de supresiones Yq no parece afectar el desarrollo psicológico y físico de los niños derivados de la ICSI.
El Uso De Marcadores Repita Mononucleótido Para La Detección De Inestabilidad De Microsatélites En Tumores De Ratón
Los tumores que carecen de falta de coincidencia de ADN actividad de reparación (MMR) de pacientes con cáncer colorectal no poliposis hereditario (HNPCC) o aquellos con cáncer colorrectal esporádico se pueden identificar por la presencia de altos niveles de inestabilidad en secuencias repetitivas conocidas como microsatélites (MSI). La evaluación del fenotipo de MSI en tumores humanos ayuda a establecer un diagnóstico clínico y se realiza con un panel de referencia de cinco repeticiones mononucleótido. Por el contrario, la detección de MSI en tumores de ratón ha demostrado ser problemática y la falta de un conjunto uniforme de indicadores para la clasificación de MSI ha impedido la comparación de resultados entre los estudios. Pusimos a prueba de MSI en tumores intestinales de ratones con deficiencia de MMR con cuatro repeticiones mononucleótido con polyA (24-37) y tres tramos nuevos marcadores con extensas colas poli (59-67) tratados. Los siete marcadores fueron sensibles a MSI en tumores con deficiencia de MMR, pero aquellos con largos tramos mononucleotide muestra grandes supresiones, que eran fácilmente distinguibles de los alelos de la línea germinal. Con un panel de los cinco repeticiones mononucleotide más sensibles y específicos, un alto nivel de MSI se detectó en el 100% de la vacuna MMR con deficiencia de tumores, pero no en los tumores con actividad MMR. Este panel novela es una mejora con respecto a las combinaciones existentes de repetir marcadores mono y dinucleótidos y debería facilitar la detección de MSI y normalizar los resultados de diferentes estudios.
Un Nuevo Método Para Biodosimetry
Métodos precisos para medir los efectos biológicos de la radiación son fundamentales para estimar el riesgo individual de la salud de la exposición a la radiación. Hemos investigado la posibilidad de utilizar la radiación inducida por mutaciones en las secuencias repetitivas de ADN para medir el daño genético causado por la exposición a la radiación. La mayoría de las secuencias repetitivas son en no codificante no regiones del genoma y alteraciones en estos loci están generalmente perjudicial. Por lo tanto, las mutaciones en no codificante secuencias repetitivas podrían acumularse, proporcionando un registro estable molecular de ADN daños causados por todas las exposiciones anteriores. Para probar esta hipótesis, se examinaron las secuencias repetitivas de ADN para identificar los lugares más sensibles a las mutaciones inducidas por la radiación y la investigación, entonces, si estas mutaciones eran estables en vivo a través del tiempo y después de exposiciones múltiples. Los marcadores microsatélites repetidos se identificaron mostraron una relación dosis-respuesta lineal hasta 1 Gy de 1 GeV / nucleón 56Fe iones y rayos gamma 137Cs en el ratón y células humanas. Repeticiones cortas en tándem en el cromosoma Y y se repite mononucleótido de cromosomas autosómicos exhibieron un aumento significativo de las mutaciones en el mayor o igual a 0,5 Gy de iones de 56Fe con frecuencias de un promedio de 4.3 a 10.3 x 10 (-3) las mutaciones / lugar / Gy / celular, lo suficientemente alto para detección directa de mutaciones en las células irradiadas. Un aumento significativo de la radiación inducida por mutaciones en repeticiones mononucleotide extendidos era detectable in vivo en la sangre de ratón y las muestras mejilla 10 y 26 semanas después de exposición a la radiación y las mutaciones estos son aditivos sobre las exposiciones múltiples. Este estudio demuestra la viabilidad de un nuevo método para biodosimetry que es aplicable a los seres humanos y otras especies. Este nuevo enfoque debe complementar los métodos existentes de biodosimetry y podría ser útil para medir la exposición a la radiación en circunstancias que no son susceptibles de los métodos actuales.
Duración De La CAG Del Receptor De Andrógenos En Los Hombres-se Repite Egipcios Fértiles E Infértiles
Los andrógenos desempeñan un papel clave en la espermatogénesis, y ejercen su efecto a través del receptor de andrógenos (AR). El gen AR tiene una secuencia de DNA repetitivo en el exón 1 que codifica una poliglutamina. La inestabilidad en la glutamina (CAG) de longitud unidad de repetición es polimórfica entre los grupos étnicos. Estudios anteriores de la relación entre la longitud de unidad de repetición y la infertilidad masculina han sido contradictorios. Para establecer el rango de los alelos de tipo salvaje en los hombres egipcios, a fin de determinar el rango de longitudes de repetición en una población de normalmente fértiles, étnicamente seleccionados los hombres egipcios. También se investigó la asociación entre la longitud de repetición de trinucleótidos en el gen AR y la infertilidad por factor masculino en una población de etnia seleccionados los hombres egipcios infértiles, que fueron comparados con los controles del grupo de concordancia fértil, étnica y de la misma edad. El estudio incluyó a 129 hombres infértiles clínicamente seleccionados egipcios que se habían programado para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides y 52 controles pareados étnicamente fértiles. La población experimental se agrupan de acuerdo con el número de espermatozoides que van desde la azoospermia no obstructiva de normozoospermia. La repetición de CAG región N-terminal del dominio del gen AR fue amplificado en el ADN de sangre periférica, y tamaño de los alelos se determinó por análisis de los fragmentos. Tamaño de los alelos de un solo nucleótido, y las tasas de polimorfismo y mutación se determinaron mediante secuenciación individuales alelos amplificados. La longitud de repetición CAG media en el grupo de azoospermia fue 18.55 + / - 2,0; en el grupo de oligozoospermia severa fue 18.21 + / - 3,42; en el grupo de oligozoospermia fue 18.27 + / - 2,93, y en el grupo normal estéril con el conteo de espermatozoides fue 17,72 + / - 2,0. En el grupo control, la longitud de repetición CAG media fue de 18,18 + / - 3,63. No se encontró correlación significativa entre la longitud de repetición CAG y el riesgo de infertilidad por factor masculino en una población étnicamente definido de los hombres egipcios. Sin embargo, una correlación significativa y positiva entre la longitud de las repeticiones de CAG y la concentración sérica de testosterona se ha demostrado. Esto sugiere la participación de la regulación epigenética vinculado a esta región.
Estructura De Alta Resolución Del Genoma Humano Por El Análisis De Una Sola Molécula De
La variación en la estructura del genoma es una fuente importante de polimorfismo genético humano: Afecta a una gran proporción del genoma y tiene una variedad de consecuencias fenotípicas relevantes para la salud y la enfermedad. A pesar de esto, la variación humana estructura del genoma está completamente caracterizado debido a una falta de métodos para descubrir una amplia gama de variantes estructurales en forma global, integral. Hemos abordado este espacio con el mapeo óptico, un alto rendimiento, de alta resolución de una sola molécula del sistema para el estudio de la estructura del genoma. Se utilizó un mapeo óptico para crear todo el genoma de mapas de restricción de una mola hidatiforme completa y tres derivados linfoblástica-líneas celulares, y validado el enfoque mediante la demostración de una fuerte concordancia con los métodos existentes. También se describen miles de nuevas variantes con tamaños que van desde kb a MB.
