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Articles by Mario Brameshuber in JoVE
JoVE General
In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici
Institute of Biophysics, Johannes Kepler Universitat Linz
Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.
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Micropatterning Per L'analisi Quantitativa Delle Interazioni Della Proteina-proteina in Cellule Viventi
Vi presentiamo un metodo per identificare e caratterizzare le interazioni tra una proteina fluoroforo ('preda') e una proteina di membrana ('esca') in cellule di mammifero dal vivo. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi contro il dominio extracellulare di esca. Esca-preda interazioni sono analizzate attraverso la ridistribuzione della preda fluorescente. Abbiamo utilizzato il metodo per caratterizzare l'interazione tra umani CD4, il ricettore più importanti nell'attivazione delle cellule T e umano Lck, la chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare. Abbiamo misurato le associazioni equilibrio da quantificare Lck ridistribuzione di CD4 microdisegni e studiato la dinamica di interazione di singola molecola imaging e photobleaching esperimenti. Oltre la struttura di chiusura conosciuto zinco, l'ancoraggio della membrana Lck in particolare ha avuto un impatto importante sull'interazione Lck-CD4, mediando il binding diretto e stabilizzare ulteriormente l'interazione di altri domini Lck. In totale, ancoraggio della membrana aumentata la durata dell'interazione di due ordini di grandezza.
Fluidità Di Membrana Plasmatica Colpisce Transitoria Immobilizzazione Dei Fosfolipidi Ossidati Nei Siti Endocitotiche Per Assorbimento Successiva
Fosfolipidi ossidati nel siero avviano risposte patofisiologici gravi durante il processo di aterogenesi. Livello cellulare è noto che questi lipidi inducono apoptosi; Tuttavia, il meccanismo di assorbimento rimane enigmatico. Abbiamo studiato qui il comportamento dei fosfolipidi ossidati fluorescente 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) nella membrana del plasma di varie linee cellulari. La sonda è stato preso dalle cellule non specifico via caveolae o pozzi rivestite da Clatrina. È interessante notare, abbiamo trovato l'assorbimento essere facilitati dalla sovraespressione della classe recettore scavenger B tipo I. ultrasensibile microscopia ci ha permesso di seguire il processo di assorbimento a livello di singola molecola; abbiamo osservato la rapida diffusione di PGPE-Alexa647 nella membrana del plasma, interrotta da soste transitori con durata di circa 0,9 s endocitotiche siti. Classe di recettori Scavenger B tipo I sovraespressione ceduto un marcato aumento nella mobilità singola molecola e di conseguenza un aumento della frequenza di immobilizzazione. In alternativa, la fluidità della membrana del plasma anche potrebbe essere aumentata trattando le cellule con alti livelli dei fosfolipidi ossidati adenoide 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine; anche in questo caso, la frequenza di immobilizzazione di PGPE-Alexa647 simultaneamente è stata aumentata. I dati dimostrano la rilevanza delle proprietà della membrana plasmatica per assorbimento di fosfolipidi ossidati e indicano un romanzo meccanismo indiretto per il controllo di endocitosi.
TCR-peptide-MHC Interazioni in Situ Visualizza Cinetica Accelerata E Maggiore Affinità
Il riconoscimento di antigeni estranei dai linfociti T è essenziale a più risposte immunitarie. Esso è guidato da cellule T antigene recettori specifici (TCRs) associazione di molecole su altre cellule a antigenica del peptide-maggiore istocompatibilità complesse (pMHC). Se produttive, queste interazioni promuovono la formazione di una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo che synaptic TCR-pMHC associazione dinamica differisce significativamente dalla associazione di TCR-pMHC in soluzione. Abbiamo usato la singola molecola fluorescenza e microscopia resonance energy transfer (FRET) tra TCRs fluorescente contrassegnati e loro ligandi pMHC affine per misurare la cinetica del legame del TCR-pMHC in situ. Quando confrontato con misurazioni di soluzione, la dissociazione di questo complesso è stata aumentata significativamente (4-12-fold). Interruzione dei polimeri di actina invertito questo effetto, che indica che la dinamica del citoscheletro destabilizzerà questa interazione direttamente o indirettamente. Tuttavia, affinità TCR per pMHC era significativamente elevati come il risultato di un grande (circa 100 volte) aumento del tasso di associazione, una probabile conseguenza dell'orientamento molecolare complementare e clustering. In cellule T helper, la molecola CD4 è stato proposto di associare in modo cooperativo con il TCR per il pMHC stesso complesso. Tuttavia, CD4 blocco ha avuto alcun effetto sull'affinità del TCR sinaptica, né fatto destabilizzare complessi TCR-pMHC, che indica che il TCR si lega pMHC indipendentemente dai CD4.
Risoluzione Temporale Delle Interazioni Della Proteina-proteina Nella Membrana Del Plasma Live-cella
Noi abbiamo recentemente messo a punto un metodo per quantificare le interazioni tra una proteina di membrana ("esca") e una proteina fluoroforo ("preda") direttamente nella membrana del plasma live-cella (metodi di natura Schwarzenbacher et al. 5:1053-1060 2008). L'idea è di cellule seme su superfici contenenti micro-fantasia di anticorpi contro il dominio di exoplasmic dell'esca e monitorare il co-patterning della preda fluorescente tramite microscopia di fluorescenza. Qui, abbiamo caratterizzato il decorso dell'esca e la preda micropattern formazione sulla semina delle cellule sul micro-biochip. Modelli si formarono immediatamente dopo il contatto delle cellule con la superficie. Le cellule sono state in grado di migrare sulla superficie del chip senza alterare il contrasto micropattern, che è rimasto costante per ore. Su singole cellule, esca contrasto possa essere soggetti a fluttuazioni, che indica che l'esca può essere rilasciato da e riconquistarono sul microdisegni. Possiamo concludere che gli studi di interazione possono essere eseguiti in qualsiasi punto di tempo dai 5 min a parecchie ore post semina. Monitoraggio interazioni con il tempo si apre la possibilità per nuove analisi, che vengono brevemente abbozzato nella sezione discussione.
Rilevamento Delle Interazioni Della Proteina-proteina Nella Membrana Del Plasma Cellulare Diretta Da Quantificando Preda Ridistribuzione Su Esca Micropatterning
La nostra comprensione dei sistemi biologici complessi è basato su strumenti di proteomica di alta qualità per il rilevamento parallelizzata e quantificazione delle interazioni della proteina. Attuali piattaforme di screening, tuttavia, si basano su misura le interazioni della proteina nei sistemi piuttosto artificiali, rendendo i risultati difficili da conferire sulla situazione in vivo. Descriviamo qui un protocollo dettagliato per la progettazione e la costruzione di un sistema per rilevare e quantificare le interazioni tra una proteina fluoroforo ("preda") e una proteina di membrana ("esca") in cellule viventi. Le cellule sono placcate su superfici micropatterned funzionalizzate con anticorpi al dominio bait exoplasmic. Esca-preda interazioni sono analizzate tramite la ridistribuzione della preda fluorescente. Il metodo è caratterizzato da elevata sensibilità fino a livello di singole molecole, la capacità di rilevare le interazioni deboli e produttività elevata, rendendo applicabile come uno strumento di screening. Il proof-of-concept è dimostrata per l'interazione tra CD4, un importante coreceptor nella segnalazione delle cellule T e Lck, una chinasi della tirosina della proteina essenziale per la segnalazione precoce T-cellulare.
Colesterolo Rallenta La Mobilità Laterale Di Un Fosfolipide Ossidato in Un Doppio Strato Lipidico Supportati
Abbiamo studiato la mobilità e la fase di partizionamento del fluorescente fosfolipidi ossidati analogo 1-palmitoyl-2-glutaroyl-sn-glycero-3-phospho-N-Alexa647-ethanolamine (PGPE-Alexa647) in lipidici supportati. Rispetto alla dihexadecanoylphosphoethanolamine fosfolipide convenzionale (DHPE)-Bodipy abbiamo trovato costanti di diffusione sempre maggiore. L'effetto è diventato drammatico quando ostacoli immobili sono stati inseriti nel doppio strato, che sostanzialmente bloccato la diffusione del DHPE-Bodipy ma difficilmente influenzato i movimenti di PGPE-Alexa647. In un doppio strato lipidico supportati di 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), le differenze di mobilità sonda livellata con maggiore contenuto di colesterolo. Utilizzando simulazioni dinamiche molecolari grossolana, potremmo attribuire questo effetto aumentato interazioni tra i fosfolipidi ossidati e la matrice della membrana, concomitante con una traduzione nella posizione dei fosfolipidi ossidati capigruppo: a zero contenuto di colesterolo, suoi capigruppo è spostato all'esterno della regione DOPC capigruppo, mentre aumentando le concentrazioni di colesterolo tira i capigruppo nel piano doppio strato.
Imaging Del Mobile Nanoplatforms Longevo Nella Membrana Di Plasma Delle Cellule Dal Vivo
La membrana del plasma è stata ipotizzata per contenere nanoscopica piattaforme di lipidi, che sono discussi nel contesto delle "zattere lipidiche" o "membrana zattere." Basata sulla biochimica e si ritiene che gli studi biologici cellulari, zattere giocano un ruolo cruciale in molti processi di segnalazione. Tuttavia, non c'è attualmente molte informazioni sulla loro dimensione, forma, stabilità, densità della superficie, composizione ed eterogeneità. Vi presentiamo qui un metodo che permette per la prima volta l'acquisizione diretta di nanoscopica longevi piattaforme con zattera-come proprietà diffonde nella membrana di plasma delle cellule dal vivo. Il nostro metodo rileva queste piattaforme di loro proprietà per assemblare un insieme caratteristico di proteine marker fluorescente o lipidi su una scala di tempo di secondi. Un protocollo speciale photobleaching è stato utilizzato per ridurre la densità superficiale di piattaforme mobili con etichette fino al livello delle macchie di diffrazione limitata ben isolati senza alterare la luminosità posto singola. La distribuzione statistica delle molecole sonda per ogni piattaforma è stata determinata mediante analisi di luminosità di singola molecola. Per la dimostrazione, abbiamo usato il marcatore di consenso zattera ancorata glicosilfosfatidilinositolo monomerico GFP e i lipidi fluorescenti BODIPY-G(M1) analogico, che preferenzialmente le partizioni in liquido-ordinato fasi. Per entrambi gli indicatori, abbiamo trovato homo-associazione colesterolo-dipendenti nella membrana del plasma di vivere cellule CHO e Jurkat T in stato di riposo, dimostrando quindi l'esistenza di piattaforme piccole, mobili, longevi, contenente queste sonde. Ulteriormente abbiamo applicato la tecnologia ai cambiamenti strutturali indirizzo nella membrana del plasma durante la scossa di calore febbre-tipo: a temperature elevate, ancorata glicosilfosfatidilinositolo monomerico GFP homo-associazione scomparve, accompagnato da un aumento nell'espressione della proteina shock termico piccolo Hsp27.
Peptidi Cationici Amphipathic Accumulano Sialilato Proteine E Lipidi Nella Membrana Del Plasma Delle Cellule Eucariotiche
Peptidi antimicrobici cationici (accampamenti) bersaglio in modo selettivo membrane batteriche da interazioni elettrostatiche con i lipidi caricati negativamente. Si è scoperto che per l'inibizione della crescita microbica una concentrazione elevata membrana CAMP è richiesto, che può essere realizzato per l'incorporazione di gruppi idrofobi all'interno del peptide. Aumentando idrofobicità, tuttavia, si riduce la selettività CAMP per batterico sopra membrane eucariote ospite, causando così il rischio di effetti collaterali dannosi. In questo studio abbiamo affrontato come cationico amphipathic peptidi-in particolare un CAMP con lisina-leucina-lisina ripete (chiamato KLK)-possono influenzare la localizzazione e la dinamica delle molecole nelle membrane eucariote. Abbiamo trovato KLK di inibire selettivamente l'endocitosi di un sottogruppo di proteine di membrana e lipidi interagendo elettrostaticamente con acido sialico caricato negativamente moiety. Caratterizzazione ultrastrutturale ha rivelato la formazione dei invaginations membrana che rappresentano intermedi di fissione o fusione, in cui il sialilato proteine e lipidi sono stati immobilizzati. Esperimenti su amphipathic cationico strutturalmente diversi peptidi (KLK, 6-MO-LF11-322 e NK14-2) ha indicato una cooperazione delle forze elettrostatiche e idrofobiche che arrestare selettivamente costituenti di membrana sialilato.
Terapia Lipidica Di Membrana in Funzione: Il Co-inducer HSP BGP-15 Attiva Vie Di Trasduzione Del Segnale Di Stress Da Rimodellamento Zattere Di Membrana Del Plasma
Invecchiamento e fisiopatologici condizioni sono legate ai cambiamenti di membrana che modulano interruttori molecolari controllata di membrana, causando espressione di heat shock protein (HSP). Hydroxylamines co-inducer HSP come BGP-15 fornire avanzati candidati terapeutici per molte malattie poiché colpiscono preferenzialmente ha sottolineato le cellule ed è improbabile che hanno effetti collaterali importanti. Nel presente studio in vitro simulazione di dinamica molecolare, esperimenti con monostrati lipidici e microscopia di fluorescenza ultrasensibile in vivo hanno mostrato che BGP-15 altera l'organizzazione dei domini di membrana ricchi di colesterolo. Imaging di nanoscopica longevi piattaforme utilizzando la zattera marcatore ancorata glicosilfosfatidilinositolo monomerica proteina fluorescente verde diffonde nella membrana del plasma live criceto cinese (CHO) dell'ovaio cella ha dimostrato che il BGP-15 impedisce la disintegrazione strutturale transiente di zattere indotta da stress da calore febbre-tipo. Inoltre, BGP-15 è stato in grado di rimodellare lipidico colesterolo-arricchito piattaforme che ricordano quelli osservano precedentemente dopo lo stress di adescamento o membrana di calore non letali e hanno dimostrati di essere obbligati per la generazione e trasmissione di segnali di stress. BGP-15 attivazione dell'espressione di HSP in cellule di melanoma B16-F10 mouse coinvolge la cascata di segnalazione Rac1 secondo l'osservazione precedente che colesterolo colpisce il targeting di Rac1 alle membrane. Infine, in una linea cellulare umana Rene embrionale dimostriamo che BGP-15 è in grado di inibire la scossa di calore rapido fattore 1 acetilazione (HSF1) monitorati durante la prima fase di stress da calore, promuovendo così una durata prolungata di HSF1 associazione agli elementi di scossa di calore. Presi insieme, i nostri risultati indicano che il BGP-15 ha il potenziale per diventare una nuova classe di farmaci per uso in 'terapia membrana lipidica' per combattere molte malattie varie misfolding di proteine, associate con l'invecchiamento.
Individuazione E Quantificazione Dell'associazione Biomolecolare Nelle Cellule Viventi Mediante Microscopia a Singola Molecola
Durante il loro movimento casuale, biomolecole sperimentare una varietà di interazioni che transitoriamente congiungere i loro percorsi. È estremamente difficile da misurare tali eventi associazione direttamente nel contesto di una cellula vivente: interazioni possono essere breve, essi possono influenzare solo una frazione minoritaria di molecole o non possono portare ad un effetto macroscopicamente osservabile. Descriviamo qui un nuovo metodo di imaging della singola molecola che permette di rilevare e quantificare le associazioni delle molecole cellulari. Da "diradamento grappoli conservando la stechiometria di etichettatura" (TOCCSL), possiamo virtualmente diluire la sonda direttamente nella cella, senza intaccare il contrassegno di fluorescenza del cluster singolo. Essenzialmente, una regione di analisi viene creata all'interno della cella di photobleaching; questa regione è privo di sonda attiva. Diffusione browniana o altri processi di trasporto portano al rientro della sonda attiva nella regione di analisi. All'inizio del processo di recupero, spot singolo può essere risolta come segnali well-separated, diffraction-limited. Standard singola molecola microscopia permette poi per caratterizzare le macchie in termini di composizione e mobilità.
