X-ray Structure D'un Canal Chlorure ClC à 3,0 A Révèle Le Fondement Moléculaire De La Sélectivité D'anions

Nature. Jan, 2002  |  Pubmed ID: 11796999

Les canaux chlorure ClC catalyser l'écoulement sélectif de Cl-ions à travers les membranes cellulaires, régulant ainsi une excitation électrique dans le muscle squelettique et le flux de sel et de l'eau à travers les barrières épithéliales. Des défauts génétiques dans la CVX Cl-canaux sous-tendent plusieurs musculaire familiale et les maladies du rein. Ici, nous présentons les structures aux rayons X de deux procaryotes ClC Cl-canaux à partir de Salmonella enterica sérotype typhimurium et Escherichia coli à 3,0 et 3,5 A, respectivement. Deux structures de révéler deux pores identiques, chaque pore étant formée par une sous-unité séparée contenue dans une protéine de membrane homodimère. Sous-unités individuelles sont composées de deux parties à peu près répétées qui s'étendent de la membrane avec des orientations opposées. Cette architecture antiparallèle définit un filtre dans lequel une sélectivité Cl-ionique est stabilisé par des interactions électrostatiques avec des alpha-hélice dipôles et par la coordination chimique avec des atomes d'azote et les groupes hydroxyle. Ces résultats fournissent une base structurelle pour mieux comprendre la fonction de ClC Cl-canaux, et d'établir les bases physiques et chimiques de leur sélectivité anion.

Crystal Structure Et Mécanisme D'un Canal Potassique Calcium-dépendants

Nature. May, 2002  |  Pubmed ID: 12037559

Les canaux ioniques présentent deux propriétés essentielles biophysiques, c'est-à conduction ionique sélective, et la capacité de la porte-ouverte en réponse à un stimulus approprié. Deux catégories générales de déclenchement canal ionique sont définis par le stimulus initiatrice: la liaison du ligand (canaux de neurotransmetteurs ou de second messager-dépendant) ou d'une membrane de tension (voltage-dépendants canaux). Ici, nous présentons la base structurelle de déclenchement ligand dans un K (+) du canal qui s'ouvre en réponse à concentration intracellulaire de Ca (2 +). Nous avons cloné, exprimé, a analysé les propriétés électriques, et déterminé la structure cristalline d'un K (+) canal (MthK) à partir de Methanobacterium thermoautotrophicum dans le Ca (2 +)-lié, état ouvert. Huit domaines RCK (régulateurs de K (+) la conductance) forment un anneau de porte à la surface de la membrane intracellulaire. La bague de déclenchement utilise l'énergie libre de Ca (2 +) liaison d'une manière simple à effectuer un travail mécanique pour ouvrir les pores.

La Conformation à Pores Ouverts Des Canaux Potassiques

Nature. May, 2002  |  Pubmed ID: 12037560

Les cellules vivantes de réguler l'activité de leurs canaux ioniques à travers un processus connu sous le nom de déclenchement. Pour ouvrir les pores, les changements de conformation de protéines doit avoir lieu dans la voie d'un canal ionique transmembranaire. KcsA et MthK, fermé et ouvert K (+) des canaux, respectivement, révèlent comment les transitions de déclenchement intervient. Pores de garniture intérieure des hélices des contenir d'articulation gating 'qui plie par environ 30 degrés. Dans une conformation rectiligne quatre hélices internes forment un faisceau, la fermeture de la proximité de sa surface de pores intracellulaire. Dans une configuration pliée les hélices intérieures splay ouvrir la création d'un éventail (12 A) porte d'entrée. Conservation de la séquence amino-acide est telle que la base commune des structures de porte dans une large gamme de K (+) des canaux, à la fois un ligand et voltage-dépendant. La conformation ouverte favorise la conduction de haut en comprimant le domaine membrane pour le filtre de sélectivité, et permet également de grands cations organiques et des peptides d'inactivation pour entrer dans le pore de la solution intracellulaire.

Sulfatation Tyrosine De CCR5 Peptide N-terminal Par Des Sulfotransférases Tyrosylprotein 1 Et 2 Suit Un Modèle Discret Et Séquence Temporelle

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Aug, 2002  |  Pubmed ID: 12169668

Le récepteur de la chimiokine CC 5 (CCR5) est le co-récepteur majeur pour l'entrée de macrophages-tropique (R5) VIH-1 dans des cellules souches cibles. Sulfatation post-traductionnelle de résidus de tyrosine dans la queue N-terminale de CCR5 est critique pour l'interaction forte affinité du récepteur avec le glycoprotéine gp120 du VIH-1 dans un complexe avec l'enveloppe CD4. Ici, nous nous sommes concentrés sur la définition précise du motif de sulfatation de l'extrémité N-terminale de CCR5 en utilisant recombinantes humaines sulfotransférases tyrosylprotein TPST-1 et TPST-2 pour modifier un peptide synthétique correspondant aux acides aminés 2-18 du récepteur (CCR5 2-18 ). Analyse des produits de réaction a été faite avec une combinaison de CLHP en phase inverse, le clivage protéolytique, et la désorption laser assistée par matrice / masse à ionisation temps de vol (MALDI-TOF MS). Nous avons constaté que CCR5 2-18 est sulfaté par les deux isoenzymes TPST conduisant à un produit final avec des résidus SULFOTYROSINE quatre. Sulfates ont été ajoutés par étapes pour le peptide production intermédiaires spécifiques avec un, deux, ou trois sulfotyrosines. Le motif de sulfatation dans ces produits intermédiaires indique que Tyr-Tyr-14 et 15 sont sulfatés en premier, suivi par Tyr-10, et enfin Tyr-3. Ces résultats représentent une analyse détaillée de la réaction de sulfatation multiple d'un substrat peptidique par TPSTs et de fournir une base structurelle pour comprendre le rôle de la sulfatation de tyrosine de CCR5 du VIH-1 et la fonction corécepteur récepteur de chimiokine.

X-ray Structure D'un Voltage-dépendants Canaux K +

Nature. May, 2003  |  Pubmed ID: 12721618

Voltage-dépendants canaux K + sont des membres de la famille des dépendant de la tension de cations (K +, Na + et Ca 2 +) des canaux qui s'ouvrent et permettre la conduction ionique en réponse à des changements de tension membrane cellulaire. Cette forme de sous-tend de déclenchement de la génération des nerfs et des potentiels d'action musculaires, entre autres processus. Ici, nous présentons la structure de KvAP, une tension dépendant de canaux K + à partir Aeropyrum pernix. On a déterminé une structure cristalline de la chaîne de pleine longueur à une résolution de 3,2 A, et de l'isolé de tension de capteur de domaine à 1,9 A, à la fois dans un complexe avec des fragments Fab monoclonaux. Le canal contient un centre d'ions de conduction des pores entourés par des capteurs de tension, qui forment ce que nous appelons «la tension du capteur paddles'-hydrophobes, cationiques, hélice-tour-hélice structures sur le périmètre extérieur de la chaîne. Charnières flexibles indiquent que les palettes de tension-capteur se déplacer en réponse aux variations de tension de membrane, portant leur charge positive à travers la membrane.

Glycosylation D'enzymatique Efficace Des Peptides Et Des Oligosaccharides De GalNAc Et UTP

Chembiochem : a European Journal of Chemical Biology. Jan, 2007  |  Pubmed ID: 17111441

Dommages Oxydatifs Induite Par Le Rayonnement Dans Le Domaine De Liaison à L'ADN Du Répresseur Lactose

The Biochemical Journal. May, 2007  |  Pubmed ID: 17263689

Comprendre les effets cellulaires de l'oxydation induite par le rayonnement nécessite le détricotage des principaux évènements moléculaires, particulièrement les dommages aux protéines avec des fonctions cellulaires importantes. L'opéron lactose de Escherichia coli est un modèle classique de systèmes de régulation génique. Son mécanisme fonctionnel implique la liaison spécifique d'une protéine, le répresseur, à une séquence d'ADN spécifique, l'opérateur. Nous avons déjà montré que, lors de l'irradiation par rayons gamma en solution, le répresseur perd sa capacité à lier l'opérateur. La radiolyse de l'eau génère des radicaux hydroxyles (OH * radicaux) qui attaquent les protéines. Dommage du domaine de liaison à l'ADN de répresseur, appelé le bandeau, est plus susceptible d'être responsable de cette perte de fonction. À l'aide de CD, de la spectroscopie de fluorescence et d'une combinaison de clivage protéolytique avec MS, nous avons examiné l'état de la pièce de tête irradié. CD a révélé un changement de conformation de dose-dépendante impliquant des États intermédiaires métastables. Les mesures de fluorescence montrent une dégradation progressive des résidus tyrosine. MS a été utilisée pour compter le nombre d'oxydations dans différentes régions de la tête et pour affiner les éléments du roulement séquence oxydé résidus. En calculant les probabilités relatives de réaction de chaque acide aminé avec OH. radicaux, on peut prédire les cibles d'oxydation plus probables. En comparant les résultats expérimentaux avec les prédictions, nous concluons que Tyr7, Tyr12, Tyr17, Met42 et Tyr47 sont les hotspots probables d'oxydation. La perte de fonction de répresseur est donc en corrélation avec des modifications chimiques et des changements de conformation de la tête.

Structure Cristalline D'un Canal Kir Kir3.1-procaryote Chimera

The EMBO Journal. Sep, 2007  |  Pubmed ID: 17703190

Le K Kir3.1 (+) du canal participe au contrôle de la fréquence cardiaque et de l'excitabilité neuronale par la protéine G et les voies de signalisation lipidique. Expression dans Escherichia coli qui a été réalisé par le remplacement de trois quarts de la pore transmembranaire avec le pores d'un canal Kir procaryote, en laissant les pores et les régions de membranes cytoplasmiques interfaciales de Kir3.1 origine. Deux structures ont été déterminées à 2,2 A. Le filtre de sélectivité est identique à la K Streptomyces lividans (+) du canal au sein de l'erreur de mesure (rmsd <0,2 A), ce qui suggère que K (+) la sélectivité nécessite la conservation extrême de la structure tridimensionnelle. Plusieurs K (+) des ions résider dans le pore et contribuent à expliquer voltage-dépendant de Mg (2 +) et le blocus polyamine et de rectification forte. Deux étranglements, au faisceau hélice intérieure et au sommet du pore cytoplasmique, peut fonctionner comme portes: une structure dans l'apex est ouvert et dans l'autre, il est fermé. Gating de l'apex est médiée par corps rigides mouvements des sous-unités cytoplasmiques des pores. Phosphatidylinositol 4,5-biphosphate interagissant résidus suggèrent un mécanisme possible par lequel le lipide de signalisation régule le pore cytoplasmique.

Sensible à L'oxydation Résidus Médient L'ADN Flexion Des Capacités De La Protéine MC1 Architecturale

Journal of Molecular Biology. Feb, 2008  |  Pubmed ID: 18155237

Le Methanosarcina thermophila protéine MC1 est une petite protéine basique qui est capable de plier l'ADN brusquement. Lorsque cette protéine est soumise à un stress oxydatif par irradiation gamma, elle perd ses propriétés d'interaction ADN originales. La protéine peut toujours lier l'ADN mais sa capacité à plier l'ADN est considérablement diminuée. Ici, nous avons utilisé différentes approches pour déterminer les oxydations qui sont responsables de cette inactivation. Grâce à une combinaison de protéolyse et spectrométrie de masse, nous avons identifié les trois résidus qui sont oxydés préférentiellement. Par mutagenèse dirigée, nous montrons que deux de ces résidus, Trp74 et Met75, sont impliqués dans la liaison de l'ADN. Leur substitution par l'alanine conduit à une forte réduction de la capacité de la protéine de plier l'ADN et une perte totale de sa capacité à reconnaître plié ADN. Prises ensemble, que ces résultats montrent que l'oxydation de ces deux résidus est responsable de l'inactivation de la protéine. En outre, les résultats confirment la relation étroite entre la courbure de l'ADN et la reconnaissance des séquences d'ADN par la protéine MC1.

Spectrométrie De Masse Des Protéines Membranaires Intrinsèques Pleine Longueur Pour Définir Les Caractéristiques Structurales Fonctionnellement Pertinents

Methods (San Diego, Calif.). Oct, 2008  |  Pubmed ID: 18976710

La détermination de la cristallisation et la structure des protéines membranaires intrinsèques reste une tâche difficile en s'appuyant sur une bonne compréhension du comportement de la protéine pour réussir. À ce jour, membrane structures protéiques sont encore loin surpassé en nombre par des structures de protéines solubles. Spectrométrie de masse est un outil puissant et polyvalent, offrant des idées profondes dans l'état de la protéine intégrale de membrane que le structuraliste entend se cristalliser. Avec les méthodes de préparation d'échantillon appropriée, il fournit des informations qui peuvent parfois prouver critiques à différents stades de la procédure de détermination de structure, de l'expression de la protéine pour modéliser le bâtiment. En outre, des connaissances précieuses sont acquise lorsque les caractéristiques structurelles identifiées sous-tendent les aspects fonctionnels importants. Electrospray et matrice assistée par laser desorption ionisation (MALDI) méthodes, cependant, visage un défi particulier lorsqu'ils traitent avec les protéines membranaires intrinsèques. Une méthode MALDI spécialement optimisée pour l'analyse des protéines membranaires est présentée ici, avec des informations détaillées sur la préparation des échantillons et dépôts, ainsi que les lignes directrices pour la détermination du domaine par protéolyse limitée. Temps vol spectrométrie de masse MALDI peut servir à faire un bon inventaire des sites d'initiation, d'adapter une protéine de forme stable, bien et à évaluer le remplacement de la sélénométhionine. Ces approches sont illustrées par quelques exemples tirés de la biologie structurale des canaux ioniques.

PREMIER APERÇU LES RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITÉ DES DÉFENSINES AVIAIRE

The Journal of Biological Chemistry. Dec, 2011  |  Pubmed ID: 22205704

Nombreux β-défensines ont été identifiés chez les oiseaux et l'utilisation potentielle de ces peptides comme solutions de rechange aux antibiotiques a été proposée, en particulier pour lutter contre les espèces de bactéries résistantes aux antibiotiques et zoonotiques. On connaît le mécanisme de l'activité antibactérienne de la β-défensines aviaire (AvBDs), et le présent travail a été effectué pour obtenir un aperçu initial l'implication des caractéristiques structurales ou résidus spécifiques dans l'activité antimicrobienne de poulet AvBD2. Poulet AvBD2 et son homologue énantiomère ont été synthétisés chimiquement. Élongation du peptide et repliement oxydatif ont été optimisées. L'activité antimicrobienne similaire mesurée pour les deux protéines L - et D-indique clairement qu'il n'y a aucun partenaire chiraux. Donc la membrane bactérienne est, selon toute vraisemblance, la cible principale. En outre, ce travail démontre que le pli en trois dimensions est requis pour une activité antimicrobienne optimale, en particulier pour les souches de bactéries Gram-positives. La structure tridimensionnelle de la NMR de poulet AvBD2 defensin affiche la structure 3 brins antiparallèle feuillet β caractéristique de β-défensines. La surface de la molécule n'affiche pas de n'importe quel caractère amphipathique. À la lumière de cette nouvelle structure et du roi séquence pingouin AvBD103b defensin structure, le consensus de famille d'aviaire β-defensin a été analysée. Résidus bien conservés ont été soulignés et souligné le rôle stratégique du résidu lysine 31 AvBD2. La variante synthétique de AvBD2-K31A affiche les modifications structurelles substantielles N-terminale et une baisse spectaculaire de l'activité. Globalement, ces résultats démontrent structurels ainsi que le rôle fonctionnel du résidu lysine critique 31 en activité antimicrobienne.

Un Inhibiteur Sélectif D'azapeptide Réversible De Protéinase Neutrophile Humain 3 Dérivé D'un Substrat De Frette De Haute Affinité

Biochemical Pharmacology. Mar, 2012  |  Pubmed ID: 22209715

Les fonctions biologiques du human neutrophil protéinase 3 (PR3) demeurent incertains en raison de sa ressemblance structurale élastase de neutrophile et son apparente redondance fonctionnelle avec ce dernier. Ainsi, tous les inhibiteurs naturels de PR3 ciblent préférentiellement l'élastase neutrophile. Nous avons conçu un inhibiteur sélectif de la PR3 basé sur la séquence de l'un de ses substrats spécifiques et sensibles de FRET. Ce azapeptide, azapro-3, inhibe la PR3 libre en solution, PR3 liés aux membranes neutrophiles et la PR3 trouvés dans les sécrétions pulmonaires brut de patients atteints de maladies pulmonaires inflammatoires chroniques. Mais il n'inhibe pas l'élastase neutrophile significativement ou cathepsine G. Contrairement à la plupart des azapeptides, cet inhibiteur n'est pas complexe de forme un acyl-enzyme stable ; C'est un inhibiteur compétitif réversible avec un non comparable à la K(m) du substrat parent. De faibles concentrations (60μM) d'azapro-3 inhibent totalement la PR3 sécrétée par les neutrophiles humains déclenchées (200, 000cells/100 μL) et la PR3 dans des homogénats de neutrophiles et dans les sécrétions pulmonaires des patients souffrant d'une inflammation pulmonaire pendant des heures. Azapro-3 a également résisté protéolyse par toutes les protéases contenues dans ces échantillons pendant au moins 2 h.