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Articles by Matthew E. Pope in JoVE
JoVE General
加上质谱肽免疫亲和富集的蛋白质定量
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC, 2Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria, 3Broad Institute of MIT and Harvard, 4Genome BC Proteomics Centre, University of Victoria, 5Plasma Proteome Institute
稳定同位素标准和捕捉反肽抗体（SISCAPA）夫妇亲和富集稳定同位素稀释质谱（MRM - MS）的肽作为代理人为各自的蛋白质肽的定量测量提供。在这里，我们描述了一个部分自动化的格式使用磁性粒子的协议。
Other articles by Matthew E. Pope on PubMed
Anti-peptide 抗体筛查： 高亲和力单克隆试剂由精制的表面等离子体共振技术的选择。
精制的表面等离子体共振法被为了衡量的动力学研究多肽绑定到兔单克隆抗体 (RabMAbs)。RabMAbs 优化的量被俘到传感器芯片从杂交瘤细胞培养上清液从解决方案跟免费的多肽具有约束力。这允许与单一抗原的肽单价相互作用的动力学测量结合位点上的抗体与亲和常数的测定无并发症亲和力考虑作出了贡献。肽结合反应了规范化抗体存在于每个样本量和简单的互动模型适合于所有绑定的答复同时。其结果是，无法确定在相同的条件下每个抗体相互作用动力学速率常数 ka 和科威特第纳尔及亲和常数 KD （kd/ka）。更高分辨率的研究涉及多肽抗原浓度进行验证单浓度测量结果的可靠性。通过结合亲和力、 活动和浓度数据，执行含有抗体的上清排名，允许选择高质量 RabMAbs 用于绑定的解决方案中的多肽。
马尔迪筛选 （MiSCREEN）： 选择 Anti-peptide 单克隆抗体免疫蛋白质组学中使用的一种方法。
介绍了可扩展甄别和选择特定的肽单克隆抗体 （mAbs） 的方法。若要标识高亲和力 anti-peptide 单克隆抗体杂交瘤细胞培养上清液中的，由磁性亲和珠跟从解决方案的绑定的特定的肽捕获抗体。定时清洗步骤后，剩余的绑定多肽被洗脱从珠和基质辅助激光解吸电离/飞行时间 (进行质谱 TOF) 质谱 (MS) 检测到。这允许单一抗原肽的单价交互测量的绑定站点上的抗体，从而反映出抗体亲和而不是亲和力。抗体，能够从解决方案阶段绑定目标肽和保留他们至少 10 分钟洗时确定了取得适当的 m/z 肽 MS 讯号的强度。这洗一次反映了几个当前免疫-质谱测定这些抗体的使用所需的最小的多肽分离时间。抗体肽具有约束力的表面等离子体共振 (SPR) 动力学分析表明选定的抗体高亲和性的是，和最重要的是，过低的离解常数。此方法称为进行质谱筛选 （MiSCREEN），从而使迅速甄别和选择高亲和力 anti-peptide 抗体，可用于各种免疫蛋白质组学的应用。为了演示中免疫-质谱测定其功能实用程序，我们使用选定、 纯净 RabMAbs 丰富自然 （胰酶） 肽的消化人类血浆。
使用肽亲和基于质谱的大规模定量蛋白质组学测定发展的评价。
稳定同位素标准并通过 antipeptide 抗体 (SISCAPA) 夫妇亲和富集的肽与稳定同位素稀释和检测捕获多反应监测质谱提供其各自的蛋白质肽作为代孕母亲的定量测量。在本报告中，我们描述了可行性研究，以确定适合做 SISCAPA 检测抗体生产的成功率，以告知大型检测发展战略。工作流设计，其中包括在这五个 proteotypic 肽蛋白单目标被用来进行免疫接种，个别兔多重免疫策略。总共有 403 proteotypic 胰酶肽代表 89 蛋白指标被用作抗原。Antipeptide 抗体酶联免疫吸附法测定法测定和 220 antipeptide 抗体表示 89 蛋白质被选为亲和纯化。这些抗体的特点是对其性能 SISCAPA 多反应监测检测方法使用胰蛋白酶消化人血浆矩阵中。检测方法生成的半数以上是能够检测目标肽浓度小于 0.5 fmol/μl 中血浆蛋白浓度小于 100 ng/ml 的对应。多路复用五肽抗原的战略是成功地在此评价研究中生成工作 100%的有针对性的蛋白质的含量测定。这些结果表明，单个实验室制定数以百计的每年的检测方法和允许 SISCAPA 检测方法的成本效益高代的规划是可行的。
食品药品评价的自动化，多路复用多肽免疫亲和富集耦合到多个反应监测质谱量化血浆中的蛋白。
无法量化大量的组织和具有精度高、 灵敏度和吞吐量葡萄糖蛋白质是生物标志物研究中的主要瓶颈。我们以前表明免疫亲和富集使用 anti-peptide 抗体 (SISCAPA) 耦合到 MRM MS 产生免疫 MRM 检测方法，可以进行多路复用来量化血浆中的蛋白具有灵敏度高、 特异性、 和精度。在这里我们报告实验室之间性能的第一次系统评估多路复用 (8-plex) 免疫 MRM MS 三个独立的实验室中。在评估了对测定的简历、 LOD、 LOQ 和恢复处理和分析的每个步骤的影响进行分阶段的研究。检测限是血浆的处于或低于 1 ng/mL 为 30 uL 测定蛋白质。测定可重复性是可以接受的核查研究，与中位数内-和跨-laboratory LOQ 的 11%以上的 CVs 和 < 14%，分别为整个免疫-MRM-质谱测定过程中，包括酶消化的血浆。胰蛋白酶消化和其所需样品处理测定变化最大的贡献，从消化蛋白质减少恢复的目标多肽。使用稳定同位素标记蛋白，作为内部标准为稳定同位素标记多肽几乎占在消化过程中的损失加倍测定精度为此同时测定精度提高 5%。我们的研究结果表明多路复用的免疫-MRM-质谱跨独立实验室可重现，并有潜力应广泛采用的矩阵一样复杂血浆中的蛋白质含量测定。
