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Articles by Mean-Hwan Kim in JoVE
JoVE Neuroscience
Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches
The Vollum Institute, Oregon Health and Science University
Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l'agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l'électrophysiologie et d'imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d'étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l'aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.
Other articles by Mean-Hwan Kim on PubMed
Protéine Kinase A Et C-induite Par La Libération D'insuline De Ca2 +-piscines Insensibles
La sécrétion d'insuline est connue à dépendre d'une augmentation de la concentration intracellulaire de Ca(2+) ([Ca(2+)](i)). Cependant, des études récentes ont suggéré que la sécrétion d'insuline peut aussi être évoquée de manière indépendante de la Ca(2+). Dans la présente étude, nous montrons que le traitement des îlots de souris intactes et RINm5F des cellules avec la protéine kinase C (PKC) activateur phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) ou protéine kinase A (PKA) activateur forskoline promu la sécrétion d'insuline sans modification de [Ca(2+)](i). En outre, la sécrétion d'insuline véhiculée par les PMA ou la forskoline a été maintenue même lorsque Ca(2+) extracellulaire ou cytosolique a été privé par traitement des cellules avec l'éthylène glycol bis(beta-amino ethyl ether)-N, N, N', N'-tétraacétique (EGTA) ou bis(2-amino phenoxy)-1, 2 éthane-N, N, N', N'-tétrakis acide tétraacétique (acétoxy méthylester) (BAPTA / AM) dans les cellules RINm5F. Les actions de sécrétagogue de l'EGR et la forskoline ont été bloquées par GF109203X et H89, inhibiteurs sélectifs de la PKC et PKA, respectivement. Traitement de PMA causé la translocation de la PKC-alpha et de PKC-epsilon du cytosol à membrane, ce qui implique que sélectivement des isoformes PKC-alpha et epsilon-PKC pourrait être important pour la sécrétion d'insuline. Cotraitement avec haute k et les PMA ont montré un niveau comparable de la sécrétion d'insuline à celle des PMA seul. En outre, PMA et la forskoline évoquée par la sécrétion d'insuline dans les cellules où la sécrétion d'insuline Ca(2+)-dépendante a été achevée. Nos données suggèrent que PKC et PKA peuvent déclencher la sécrétion d'insuline pas uniquement de manière sensible à la Ca(2+) mais aussi d'une façon de Ca(2+)-indépendante de poules libérables distinctes.
Règlement De L'exocytose De Récepteurs Purinergiques Dans Les Cellules épithéliales Des Canaux Pancréatiques
Dans les cellules épithéliales, plusieurs signaux intracellulaires régulent la sécrétion de grosses molécules comme la mucine par exocytose et le transport des ions à travers les canaux et les transporteurs. À l'aide de fibre de carbone ampérométrie, nous avons déjà indiqué que l'exocytose des granules de sécrétion pancréatique chien cellules épithéliales (PDEC) peuvent être stimulées par l'activation pharmacologique-protéine kinase AMPc dépendante (PKA) ou de la protéine kinase C (PKC), ainsi que par une augmentation de concentration Ca2 + libre intracellulaire ([Ca2 +] i). Dans cette étude, nous avons examiné si l'exocytose dans ces cellules est modulée par l'activation des récepteurs P2Y endogènes, augmenter le cAMP et [Ca2 +] i. faibles concentrations d'ATP (< microM 10) intracellulaire Ca2 + oscillation induite mais pas significatif exocytose. en revanche, 100 microM ATP induit un soutenue [Ca2 +] i rise et accéléré l'exocytose septuple. la contribution de Ca2 + ou camps voies d'exocytose a été testée à l'aide du chélateur du Ca2 + BAPTA ou les inhibiteurs de la PKA H-89 ou Rp-8-bromoadénosine 3 «, 5 »-monophosphorothioate cyclique. suppression de [Ca2 +] je prends la parole ou l'inhibition de la PKA chacune partiellement réduite exocytose ; lorsqu'il est combiné, ils ont aboli exocytose. en conclusion, ATP, à des concentrations > 10 microM stimule l'exocytose de PDEC par Ca2 + et de voies de camps.
Récepteurs Purinergiques Couplé à Des Signaux De Ca2 + Intracellulaires Et Exocytose Dans Les Cellules Neuroendocrines La Prostate De Rat
Cellules neuroendocrines la prostate de rat (RPNECs) affichent une variété de canaux ioniques et pièce alpha-régulation de la concentration cytosolique heterodimeric ([Ca(2+)])(c). Dans cette étude, régulation purinergique du [Ca(2+)](c) et exocytose a étudié chez fraîchement isolées RPNECs uniques montrant l'immunoréactivité de la chromogranine A. La présence de récepteurs P2X et P2Y dans RPNECs a été vérifiée par l'activation transitoire des canaux cationiques perméable à la Ca(2+) et la libération de heterodimeric des réserves intracellulaires par l'ATP extracellulaire, respectivement. Le courant entrant transitoire de cationique est effectivement activé par alpha, bêta-méthylèneadénosine 5'-triphosphate (alpha, bêta-MeATP) et bloqué par 2', 3 'adénosine - O-(2,4,6-trinitrophényl) 5'-triphosphate, suggérant la présence d'un sous-type P2X(1) ou P2X(3). La libération de heterodimeric stockée, ATP et UTP étaient tout aussi puissant, qui indique l'expression fonctionnelle du sous-type P2Y(2) ou P2Y(4). L'ARNm pour P2X(1) et P2Y(2) ont été confirmés par analyse de reverse transcription-PCR de RPNECs. L'application d'alpha, bêta MeATP induite par des augmentations importantes et transitoires [Ca(2+)](c), qui n'étaient pas atténué par les bloqueurs de canaux heterodimeric activés par tension ou par un appauvrissement des réserves intracellulaires de heterodimeric, mais ont été abolies en omettant heterodimeric extracellulaire. L'application de l'UTP augmente [Ca(2+)](c) à 55 % du pic Delta[Ca(2+)](c) induite par alpha, bêta-MeATP. L'application d'alpha, bêta MeATP exocytotique réponses de RPNECs sous la supervision de capacitance et de fibre de carbone ampérométrie mesures induites. À nos intérêts, l'application de l'UTP n'induisait pas ampérométrique courants, mais réduit la capacité de la membrane, indiquant une endocytose net. D'après ces résultats, nous postulons qu'une forte hausse [Ca(2+)](c) par l'afflux de médiation P2X heterodimeric est requise pour l'exocytose, alors que la libération lente de heterodimeric stockée provoque l'endocytose dans RPNECs.
Partie C-terminale D'AGPR Stimule La Sécrétion D'insuline Par L'intermédiaire De La Libération De Calcium Dans Les Cellules Bêta Du Pancréas Rin5mf
Protéine agouti (AGPR) est un peptide orexigène qui se compose de trois parties ; les aminés N-terminus, la partie du milieu et l'extrémité c-terminale du carboxyle. AGPR a été impliqué dans la signalisation de cellules différentes, mais le rôle précis de chacune des parties ne sont actuellement pas claires. Dans cette étude, nous avons tenté de déterminer quelle partie d'AGPR était critique pour la sécrétion d'insuline. Nous avons trouvé que l'extrémité C-terminale d'AGPR augmente notamment la concentration de calcium intracellulaire dans les cellules bêta du pancréas Rin5mf manière PLC-dépendante, tandis que la partie du milieu et l'extrémité C-terminale ont peu d'effets sur la libération de calcium. Cette réponse de calcium peut être observée dans les cellules fraîchement isolées de beta primaires aussi. En outre, mesure ampérométrique révèle que l'extrémité C-terminale d'AGPR augmente le taux d'exocytose dans les cellules Rin5mf. De plus, nous montrons que cette région d'AGPR est responsable de la sécrétion d'insuline en fonction de la PLC. Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'extrémité C-terminale d'AGPR peut participer à la sécrétion de l'insuline dans les cellules bêta du pancréas, par le biais de la modulation de la libération de calcium.
Protéase-activated Receptor-2 Augmente L'exocytose Par L'intermédiaire De Multiples Voies De Transduction De Signal Dans Les Cellules épithéliales Du Canal Pancréatique
Protéase-activated receptor-2 (PAR-2) est activé lorsque la trypsine Clive son terminus NH(2) d'exposer un ligand captif. Nous avons démontré précédemment que PAR-2 active des canaux ioniques dans les cellules épithéliales du canal pancréatique (PDEC). Utilisant des sondes fluorescentes optiques en temps réel, protéine de fluorescence jaune-Epac1-protéine de fluorescence cyan pour le cAMP, protéine fluorescente verte améliorée PH(PLC-delta1) pour phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate et la protéine kinase Cgamma (PKCgamma) - C1 - jaune fluorescence de diacylglycérol, nous définissons maintenant les voies de signalisation médiation PAR-2 effet chez chien PDEC. Bien que l'activation de PAR-2 ne stimule pas une augmentation de l'AMPc, il induit une phospholipase C à hydrolyser le phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate en inositol 1,4,5-trisphosphate et diacylglycérol. Mobilisation intracellulaire de Ca(2+) de l'inositol trisphosphate sensible-1,4,5 Ca(2+) stocke et un afflux de Ca(2+) ultérieur par magasin fonctionnant Ca(2+) canaux entraîne une augmentation biphasique concentration intracellulaire de Ca(2+) ([Ca(2+)](i)), mesurée à l'aide de colorants Indo-1. Ampérométrie monocellulaires ont démontré que cette augmentation [Ca(2+)](i) dans tour provoque un biphasique augmenter dans l'exocytose. Une analyse de protéine kinase a révélé que la trypsine active également les isozymes de la PKC pour stimuler l'exocytose supplémentaire. Parallèle à l'augmentation de l'exocytose, sécrétion de mucine du PDEC est également induite par la trypsine ou le peptide activant PAR-2. Compatible avec la localisation séreuse de PAR-2, 1 microm luminale trypsine n'induisait pas exocytose dans les monocouches PDEC polarisées ; en revanche, la trypsine microm 10 à 37 degrés C endommagé de la barrière épithéliale suffisamment afin qu'elle puisse atteindre et activer la séreuse PAR-2 afin de stimuler l'exocytose. Ainsi, dans le PDEC, PAR-2 activation augmente [Ca(2+)](i) et active la PKC pour stimuler la sécrétion de l'exocytose et de mucine. Ces fonctions peuvent médier le rôle protecteur signalé de PAR-2 dans les différents modèles de pancréatite.
Glutamate Glutamate Induite Par Le Transporteur De Sécrétion Dans La Glande Pinéale Chez Les Mammifères
Transporteurs de glutamate sont exprimées tout au long de la CNS, où leur rôle majeur est d'effacer le glutamate libéré des terminaisons présynaptiques. Nous rapportons ici une nouvelle fonction du transporteur dans les pinéalocytes de rat. Ce transporteur électrogénique menée courant entrant en réponse à L-glutamate et L - ou D-aspartate et dépolarisé la membrane dans les expériences de patch-clamp. Imagerie Ca2 + a démontré que la dépolarisation induite par le transporteur induit un afflux significatif de Ca2 + par le biais de canaux Ca2 + voltage-dépendants. La hausse de Ca2 +, enfin, évoquée par exocytose de glutamate tel que détecté par ampérométrie en fibre de carbone et par HPLC. Dans la glande pinéale tranches avec des pinéalocytes des, glutamate libéré des cellules effectivement activé transporteurs de glutamate dans les cellules voisines. Le Ca2 + signal généré par la dépolarisation de KCl ou l'acétylcholine propagée par le biais de plusieurs couches de cellules en vertu de la régénération « la libération de glutamate induite par le glutamate. » Par conséquent, nous suggérons que les transporteurs de glutamate médient élévation synchronisée de L-glutamate et ainsi efficacement régulent la sécrétion de mélatonine par l'intermédiaire de récepteurs de glutamate métabotropique inhibitrice précédemment identifiés dans la glande pinéale.
Contrôle De La Mobilité De Granule Et Exocytose Par Le Ca2 +-dépendante Formation D'actine-F Dans Le Pancréas Conduit Les Cellules épithéliales
Élévation de la concentration intracellulaire de Ca(2+) ([Ca(2+)](i)) déclenche l'exocytose des granules de sécrétion dans l'épithélium du canal pancréatique. Dans cette étude, nous constatons que le signal de contrôle également le mouvement de granule. Mouvements des granules fluorescent étiquetés s'est arrêté brusquement après une [Ca(2+)](i) croissance, cinétiquement coïncide avec la formation de filaments d'actine (actine-F) dans le cytoplasme en entier. À haute résolution, le réseau d'actine F nouvel était si dense que les structures cellulaires de taille de granule est apparu physiquement piégés dedans. Dépolymérisation de l'actine F avec Latrunculine B bloqué tant la formation de l'actine F et l'arrestation de granules. Fait intéressant, lorsque surveillé avec la microscopie de fluorescence de réflexion totale interne, les granules immobilisées encore déplacé lentement et de manière concertée vers la membrane plasmique. Cette translocation de groupe a été abolie par les bloqueurs de la myosine. Exocytose mesurée par microamperometry a suggéré que la formation d'une exocytose de meshwork inhibée actine F dense à petits Ca(2+) rises < 1 microm. Plus grande [Ca(2+)](i) rises accrue exocytose à cause de la translocation de coordonner des granules et de fusion de la membrane. Nous proposons que le gel de Ca(2+) dépendant des granules filtre les entrées faibles mais permet l'exocytose sous entrées plus fortes en contrôlant les mouvements de granule.
Caractéristiques Et Fonctions De {alpha}-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionate Récepteurs Exprimés Dans Des Pancréas De Souris {alpha}-cellules
Cellules des îlots pancréatiques utiliser neurotransmetteurs tels que la L-glutamate de réguler la sécrétion de l'hormone. Nous avons déterminé quels types de cellules des îlots pancréatiques de souris dans les canaux ionotropiques du glutamate exprimer des récepteurs de l'iGluRs) et décrire les propriétés biophysiques et détaillées des rôles physiologiques de ces récepteurs. Courants à travers iGluRs et la dépolarisation de la membrane résultant ont été mesurés avec des méthodes de patch-clamp. Ca (2 +) l'influx par voltage-dépendants Ca (2 +) et les canaux Ca (2 +)-a évoqué l'exocytose ont été détectés par le Ca (2 +) d'imagerie et de fibre de carbone microamperometry. Attendu que iGluR2 immunoréactivité des récepteurs du glutamate a été détectée en utilisant des anticorps spécifiques chez la souris par immunocytochimie identifié alpha-et bêta-cellules, iGluRs fonctionnels ont été détectés seulement dans les alpha-cellules. Application rapide de L-glutamate de cellules provoquée activant rapidement et désensibiliser courants entrants à -60 mV. Par des critères fonctionnels, les courants ont été identifiés comme alpha-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionate (AMPA) des récepteurs. Ils ont été activés et désensibilisés par l'AMPA, et ont été activés que faiblement par le kainate. La désensibilisation par l'AMPA a été inhibée par cyclothiazide, et les courants ont été bloqués par la 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2 ,3-dione (CNQX). IGluRs Islet a montré une perméabilité cationique non sélectif avec un faible teneur en Ca (2 +) perméabilité (P (Ca) / P (Na) = 0,16). L'activation des récepteurs AMPA induit une séquence d'actions cellulaires dans les cellules alpha-: 1) la dépolarisation de la membrane par 27 + / - 3 mV, 2) augmentation de la concentration intracellulaire de Ca (2 +) principalement médiée par voltage-dépendants Ca (2 + canaux) activées lors de la dépolarisation de la membrane, et 3) l'augmentation de l'exocytose par le Ca (2 +) hausse. En conclusion, iGluRs exprimé chez la souris alpha-cellules ressemblent à faible teneur en Ca (2 +)-perméable récepteur AMPA dans le cerveau et peut stimuler l'exocytose.
