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Articles by Mean-Hwan Kim in JoVE
JoVE Neuroscience
Patch-clamp Misure di capacità e Ca 2 + Imaging terminazioni nervose della retina singola in Fette
The Vollum Institute, Oregon Health and Science University
Qui descriviamo un protocollo per la preparazione di agar-embedded fette della retina che sono adatti per elettrofisiologia e Ca2 + imaging. Questo metodo permette di studiare nastro di tipo sinapsi in microcircuiti della retina mediante diretta patch-clamp registrazioni dei singoli terminali nervosi presinaptici.
Other articles by Mean-Hwan Kim on PubMed
Proteina Chinasi A - E C-induced Rilascio Di Insulina Da Ca2 +-piscine Insensibile
Secrezione di insulina è conosciuta per dipendere da un aumento della concentrazione intracellulare di Ca(2+) ([Ca(2+)](i)). Tuttavia, recenti studi hanno suggerito che la secrezione di insulina può anche essere evocata in modo indipendente dal Ca(2+). Nel presente studio ci mostra che il trattamento degli isolotti del mouse intatto e le cellule RINm5F con protein chinasi C (PKC) attivatore forbolo miristato 12 13-acetato (PMA) o proteina chinasi A (PKA) attivatore forskolina promosso secrezione di insulina con nessun cambiamento di [Ca(2+)](i). Inoltre, la secrezione di insulina mediata da PMA o la forskolina è stata mantenuta anche quando Ca(2+) extracellulare o citosolica fu tolta dal trattamento delle cellule con glicole etilenico bis(beta-amino ethyl ether)-N, N, N', N'-acido etilendiamminotetraacetico (EGTA) o 1,2-bis(2-amino phenoxy) etano-N, N, N', N'-tetrakis acido etilendiamminotetraacetico (acetossi metilestere) (BAPTA / AM) nelle cellule RINm5F. Le azioni secretagogo del PMA e forskolina sono state bloccate da GF109203X e H89, inibitori selettivi per PKC e PKA, rispettivamente. Trattamento di PMA causato traslocazione di PKC-alfa e PKC epsilon dal citosol alla membrana, implicando che selettivamente isoforme di PKC-alfa e PKC epsilon potrebbe essere importante per la secrezione di insulina. Co-Treatment ad alto K(+) e PMA ha mostrato un livello comparabile di secrezione di insulina a quello della PMA da solo. Inoltre, PMA e forskolina evocato la secrezione di insulina nelle cellule dove è stata completata la secrezione di insulina Ca(2+)-dipendente. I nostri dati suggeriscono che PKC e PKA può suscitare la secrezione di insulina non solo in maniera sensibile Ca(2+) ma anche in maniera indipendente Ca(2+) da piscine rilasciabile separate.
Regolamento Di Esocitosi Di Recettori Purinergici Nelle Cellule Epiteliali Del Dotto Pancreatico
Nelle cellule epiteliali, diversi segnali intracellulari regolano la secrezione di molecole di grandi dimensioni quali la mucina tramite esocitosi e il trasporto di ioni attraverso canali e trasportatori. Utilizzando fibra di carbonio amperometria, abbiamo riferito in precedenza che esocitosi dei granuli secretori nel dotto pancreatico cane cellule epiteliali (PDEC) possono essere stimolate da farmacologico attivazione della chinasi di proteina accampamento-dipendente (PKA) o proteina chinasi C (PKC), nonché da un incremento del libero Ca2 + concentrazione intracellulare ([Ca2 +] i). In questo studio, abbiamo esaminato se esocitosi in queste cellule sono modulata dall'attivazione dei recettori endogeni di P2Y, che aumentano il cAMP e [Ca2 +] i. basse concentrazioni di ATP (< 10 microM) intracellulare Ca2 + oscillazione indotta ma nessun significativo esocitosi. In contrasto 100 microM ATP indotta da una sostenuta [Ca2 +] i rise e aumentato il tasso di esocitosi sevenfold. il contributo di Ca2 + o percorsi cAMP per esocitosi è stato testato utilizzando il Ca2 + chelante BAPTA o gli inibitori PKA H-89 o Rp-8-bromoadenosine 3', 5'-ciclico monophosphorothioate. rimozione di [Ca2 +] i rise o inibizione della PKA ciascuno parzialmente ridotto esocitosi; quando combinati, hanno abolito esocitosi. In conclusione, ATP a concentrazioni > 10 microM stimola esocitosi da PDEC attraverso il Ca2 + e percorsi cAMP.
Recettori Purinergici Accoppiati a Segnali Di Ca2 + Intracellulare Ed Esocitosi Di Cellule Neuroendocrine Della Prostata Di Ratto
Cellule neuroendocrine prostatiche ratto (RPNECs) visualizzare una varietà di canali ionici ed esibiscono alfa-adrenergici regolamento della concentrazione citosolica di Ca(2+) ([Ca(2+)])(c). In questo studio, purinergic regolamento di [Ca(2+)](c) ed esocitosi fu indagato in appena isolato singolo RPNECs mostrando immunoreattività Cromogranina A. La presenza di recettori P2X e P2Y in RPNECs è stata verificata l'attivazione transitoria dei canali cationici Ca(2+)-permeabile e il rilascio di Ca(2+) dai depositi intracellulari di ATP extracellulare, rispettivamente. La corrente transitoria di cationica verso l'interno in modo efficace è stata attivata da alfa, beta-methyleneadenosine 5'-trifosfato (alfa, beta-MeATP) e bloccato da 2', 3 'adenosina - O-(2, 4,6-trinitrophenyl) 5'-trifosfato, suggerendo la presenza di un sottotipo di P2X(1) o P2X(3). Per il rilascio di Ca(2+) memorizzati, ATP e UTP erano altrettanto potente, che indica l'espressione funzionale del sottotipo P2Y(2) o P2Y(4). il mRNA per P2X(1) e P2Y(2) sono stati confermati da analisi PCR-trascrizione inversa di RPNECs. L'applicazione di alfa, beta-MeATP indotta da grandi e transitori aumenti in [Ca(2+)](c), che non sono stati attenuati i bloccanti dei canali Ca(2+) voltaggio-attivati o lesive intracellulare Ca(2+) negozi, ma sono stati aboliti omettendo Ca(2+) extracellulare. L'applicazione di UTP aumentata [Ca(2+)](c) al 55% del picco Delta[Ca(2+)](c) indotta da alfa, beta-MeATP. L'applicazione di alfa, beta-MeATP indotta da questo risposte di RPNECs come monitorate dalla capacitanza e fibra di carbonio amperometria le misurazioni. Di nostro interesse, l'applicazione di UTP non ha indotto le correnti amperometrico, ma riduce la capacità della membrana, che indica un netto endocitosi. Da questi risultati, abbiamo postulato che un forte aumento [Ca(2+)](c) dall'afflusso Ca(2+) P2X-mediata è richiesto per esocitosi, considerando che il relativamente lento rilascio di stored Ca(2+) induce endocitosi in RPNECs.
Parte C-terminale Di AgRP Stimola La Secrezione Di Insulina Attraverso Il Rilascio Di Calcio Nelle Cellule Beta Del Pancreas Rin5mf
Agouti-related protein (AgRP) è un peptide di orexigenic che si compone di tre parti; il terminus amminico (N) capolinea, la parte centrale e carbossilico (C)-. AgRP è stata implicata nella segnalazione delle cellule diverse, ma il ruolo preciso di ogni parti sono attualmente poco chiaro. In questo studio, abbiamo cercato di determinare quale parte di AgRP è stato fondamentale per la secrezione di insulina. Abbiamo trovato che il C-terminale di AgRP in particolare aumenta la concentrazione di calcio intracellulare nelle cellule beta del pancreas Rin5mf modo PLC-dipendente, mentre la parte centrale e C-terminale sono piccoli effetti sul rilascio di calcio. Questa risposta di calcio può essere osservata anche nelle cellule beta primarie appena isolate. Inoltre, misurazione amperometrica rivela che il C-terminale di AgRP aumenta il tasso di esocitosi di cellule Rin5mf. Abbiamo ulteriormente mostrano che questa regione di AgRP è responsabile della secrezione di insulina in modo dipendente dal PLC. Presi insieme, questi risultati indicano che il C-terminale di AgRP può partecipare la secrezione di insulina nelle cellule beta del pancreas, attraverso la modulazione del rilascio di calcio.
2-Recettori Attivati Da Proteasi Aumenta Esocitosi Attraverso Molteplici Vie Di Trasduzione Del Segnale Nelle Cellule Epiteliali Del Dotto Pancreatico
Recettori attivati da proteasi-2 (PAR-2) viene attivato quando tripsina fende capolinea NH(2) per esporre un ligando legato. Abbiamo precedentemente dimostrato che PAR-2 attiva i canali ionici nelle cellule epiteliali del dotto pancreatico (PDEC). Utilizzando sonde fluorescenti ottiche in tempo reale, proteina proteina-Epac1-giallo fluorescenza fluorescenza ciano per cAMP, PH(PLC-delta1)-enhanced proteina fluorescente verde per fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato e proteina chinasi Cgamma (PKCgamma) - C1 - giallo fluorescenza per diacilglicerolo, definiamo ora le vie di segnalazione mediando PAR-2 effetto nel cane PDEC. Anche se PAR-2 attivazione non stimola un aumento del cAMP, esso induce la fosfolipasi C per idrolizzare fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato in inositolo 1.4.5-trifosfato e diacilglicerolo. Intracellulare Ca(2+) mobilitazione da inositolo 1.4.5-trifosfato-sensitive Ca(2+) memorizza e un afflusso di Ca(2+) successiva attraverso canali Ca(2+) store-operati causano un aumento bifasico in concentrazione intracellulare di Ca(2+) ([Ca(2+)](i)), misurato con la tintura di Indo-1. Cella singola amperometria ha dimostrato che questo aumento [Ca(2+)](i) a sua volta causa un bifasico aumentare nell'esocitosi. Un'analisi della chinasi di proteina ha rivelato che tripsina attiva anche isoenzimi PKC per stimolare ulteriori esocitosi. Parallelamente l'esocitosi aumentata, secrezione di mucina da PDEC è stata anche indotta da tripsina o del peptide di attivazione di PAR-2. Coerente con la localizzazione sierose di PAR-2, 1 microm Luminale tripsina non ha indotto esocitosi in monostrati PDEC polarizzate; d'altra parte, 10 microm tripsina a 37 gradi C danneggiato la barriera epiteliale sufficientemente che potrebbe raggiungere e attivare le sierose PAR-2 per stimolare esocitosi. Così, in PDEC, PAR-2 attivazione aumenta [Ca(2+)](i) e attiva la PKC per stimolare la secrezione di esocitosi e mucina. Queste funzioni possono mediare il ruolo protettivo segnalato di PAR-2 in diversi modelli di pancreatite.
Glutammato Glutammato Mediata Da Trasportatore Secrezione Della Ghiandola Pineale Dei Mammiferi
I trasportatori di glutammato sono espresse in tutto lo SNC dove loro ruolo principale è quello di cancellare glutammato rilasciato dai terminali presinaptiche. Riportiamo una funzione romanzo del trasportatore nel ratto pinealocytes. Questo trasportatore elettrogeniche condotto corrente verso l'interno in risposta alla L-glutammato e L-D-aspartato e depolarized la membrana in esperimenti di patch-clamp. Ca2 + imaging ha dimostrato che la depolarizzazione mediata da trasportatore indotta da un afflusso significativo del Ca2 + attraverso canali Ca2 + voltaggio-dipendenti. L'aumento di Ca2 + evocato infine esocitosi glutammato come rilevato da fibra di carbonio amperometria e HPLC. Nella ghiandola pineale fette con densamente pinealocytes, glutammato rilasciato dalle cellule efficacemente attivato i trasportatori di glutammato in celle vicine. Il Ca2 + segnale generato dalla depolarizzazione di KCl o acetilcolina propagato attraverso diversi strati cellulari in virtù della rigenerativa "indotta da glutammato glutammato release." Pertanto, suggeriamo che i trasportatori di glutammato mediano sincronizzato elevazione del L-glutammato e quindi efficacemente sottoregola secrezione di melatonina attraverso i recettori del glutammato metabotropico inibitorio precedentemente identificati nella ghiandola pineale.
Controllo Della Mobilità Del Granulo Ed Esocitosi Di Ca2 +-dipendente Dalla Formazione Di F-actina in Pancreatico Cellule Epiteliali Del Condotto
Elevazione della concentrazione intracellulare di Ca(2+) ([Ca(2+)](i)) innesca esocitosi dei granuli secretori nell'epitelio del dotto pancreatico. In questo studio, troviamo che il segnale controlla anche il movimento di granulo. Moti di granuli fluorescente contrassegnati bruscamente interrotto dopo un [Ca(2+)](i) aumento, cineticamente coincida con formazione di actina filamentosa (F-actina) nel citoplasma intero. Ad alta risoluzione, il nuovo reticolo di F-actina è stato così denso che strutture cellulari di dimensioni granulo apparvero fisicamente intrappolate in essa. Depolimerizzazione di F-actina con latrunculin B bloccato sia la formazione di F-actina e l'arresto dei granuli. È interessante notare che, quando monitorati con microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale, i granuli immobilizzati ancora spostato lentamente e concertata verso la membrana plasmatica. Questa traslocazione di gruppo è stata abolita da bloccanti della miosina. Esocitosi misurata da microamperometry ha suggerito che formazione di un denso esocitosi di trabecolato inibito F-actina a piccoli aumenti di Ca(2+) < 1 microm. Più grandi [Ca(2+)](i) aumenti aumento esocitosi a causa della traslocazione di coordinare dei granuli e la fusione alla membrana. Proponiamo che il congelamento Ca(2+)-dipendente dei granuli filtra deboli ingressi ma permette esocitosi sotto forti ingressi di controllo dei movimenti del granulo.
Caratteristiche E Funzioni Di {alpha}-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate Recettori Espressi Nel Mouse Del Pancreas {alpha}-cellule
Cellule insulari pancreatiche utilizzano neurotrasmettitori come l-glutammato di regolare la secrezione dell'ormone. Abbiamo determinato quali tipi di cellule in isolotti pancreatici del mouse express canali di recettori ionotropici glutammato (iGluRs) e descrivere le proprietà biofisiche dettagliate e ruoli fisiologici di questi recettori. Correnti attraverso iGluRs e la conseguente depolarizzazione della membrana sono state misurate con metodi di patch-clamp. CA(2+) afflusso attraverso canali Ca(2+) tensione-gated e Ca(2+)-evocato esocitosi sono stati rilevati da Ca(2+) imaging e fibra di carbonio microamperometry. Considerando che iGluR2 immunoreattività di glutammato recettore è stato rilevato utilizzando anticorpi specifici in immunocytochemically identificato mouse alfa - e beta-cellule, iGluRs funzionali sono state rilevate solo nelle cellule alfa. Veloce applicazione del l-glutammato di celle ha suscitato rapidamente attivando e desensibilizzazione verso l'interno delle correnti a -60 mV. Da criteri funzionali, le correnti sono state identificate come alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate recettori (AMPA). Essi sono stati attivati e insensibili da AMPA e sono stati attivati solo debolmente da Kainato. La desensibilizzazione da AMPA è stato inibito da cyclothiazide, e le correnti sono state bloccate da 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (CNQX). Isolotto iGluRs ha mostrato permeabilità non selettivi catione con una bassa permeabilità Ca(2+) (P(Ca)/P(Na) = 0,16). Attivazione dei recettori AMPA indotta da una sequenza di azioni cellulare nelle cellule alfa: 1) la depolarizzazione della membrana da 27 + 3 mV, 2) aumento intracellulare Ca(2+) principalmente mediata dalla tensione-gated Ca(2+) canali attivati durante la depolarizzazione della membrana e 3) aumento dell'esocitosi di aumento Ca(2+). In conclusione, iGluRs espresso in cellule di topo alfa assomigliano a basso Recettore AMPA permeabile Ca(2+) nel cervello e può stimolare esocitosi.
