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Articles by Mean-Hwan Kim in JoVE
JoVE Neuroscience
パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +イメージング
The Vollum Institute, Oregon Health and Science University
ここでは、電気生理学とCa2 +イメージングに適した寒天包埋網膜スライスを調製するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは1つが、単一のシナプス前神経末端の直接パッチクランプ記録を用いて網膜マイクロ回路のリボン型シナプスを研究することができます。
Other articles by Mean-Hwan Kim on PubMed
蛋白質キナーゼ A と C 刺激インスリン放出から Ca 2 +-区別しないプール。
インスリン分泌細胞内カルシウム濃度 ([Ca(2+)](i)). の増加に依存する知られています。しかし、最近の研究は、Ca(2+) に依存しない方法でインスリン分泌をまた誘発できることを示唆しています。本研究では私達はそのままマウスの膵島と RINm5F 細胞蛋白質キナーゼ C (PKC) アクティベーター ホルボール 12-ミリスチン酸 13 アセテート （PMA） や蛋白質キナーゼ A(PKA) アクティベーター フォルスコリンの治療させた。 の変更なしでのインスリン分泌を促進することを示す細胞または細胞内カルシウム エチレング bis(beta-amino ethyl ether)-N, N, N と細胞の治療によって奪われたときはまた、インスリン分泌の PMA またはフォルスコリンによって媒介維持された '、N'-四酢酸 (胃管式) または 1, 2， bis(2-amino phenoxy) エタン-N, N, N', N'-四酸テトラキス (アセトキシ メチルエステル） (これら/午前） RINm5F 細胞における。PMA とフォルスコリンの分泌促進行動によって GF109203X と選択的阻害薬 PKC ・ PKA、H89 それぞれブロックされました。PMA 治療 PKC α と PKC イプシロンの転流から細胞質膜を選択的に PKC α と PKC イプシロン アイソ フォーム インスリン分泌のために重要かもしれないことを示唆する原因。Co-treatment 高に於いてと PMA と同等レベルのインスリン分泌は PMA に単独で示した。さらに、PMA およびフォルスコリン Ca(2+) 依存性インスリン分泌が完成した細胞におけるインスリン分泌を誘発しました。我々 のデータは PKC ・ PKA インスリン分泌も別々 の脱着可能なプールから Ca(2+) に依存しない方法で Ca(2+) に敏感な方法でだけでなく引き出すことができることをお勧めします。
膵管上皮細胞におけるプリン受容体エキソサイトーシスの規制。
上皮細胞で、いくつかの細胞内シグナル ムチン エキソサイトーシス経由などの大きな分子の分泌とイオン チャネル ・ トランスポーターの輸送を調節します。炭素繊維した電流測定法を使用して、我々 は以前そのエキソサイトーシス報告の分泌顆粒における犬膵管上皮細胞 (PDEC) cAMP 依存プロテインキナーゼ (PKA) または蛋白質キナーゼ C (PKC) の薬理活性化によってだけでなく、細胞内遊離 ca 2 + 濃度の増加によって刺激されること ([ca 2 +] 私は）。エキソサイトーシスこれらの細胞のキャンプと [ca 2 +] i. 低濃度 ATP の増加、内因性の P2Y 受容体活性化によって変調されるかどうか、我々 検討 (< 10 microM) による細胞内 ca 2 + 振動がない重要なエキソサイトーシス。 対照的に、100 の microM ATP 誘起は持続的な [ca 2 上昇し、開口放出率を 7 倍増加 +]。 ca 2 + やキャンプ経路エキソサイトーシスへの貢献、ca 2 + キレート剤これらまたは PKA 阻害剤と H 89 または Rp 8 bromoadenosine に 3', 5' を使用してテストされました-繰返し monophosphorothioate。 除去 [ca 2 +] 私は上昇または PKA の阻害はそれぞれ部分的エキソサイトーシス減少; 結合されたとき、彼らはエキソサイトーシス。 結論、ATP 濃度で廃止目 10 microM エキソサイトーシスから ca 2 + およびキャンプの経路を通して PDEC を刺激します。
プリン受容体は細胞内 Ca 2 + シグナルとエキソサイトーシス ラット前立腺神経内分泌細胞に結合。
ラット前立腺神経内分泌細胞 (RPNECs) イオン チャネルのさまざまな表示し、展示 α アドレナリンの規制のゾル性細胞質カルシウム濃度 ([Ca(2+)])(c)。本研究では、プリンの規制 [Ca(2+)](c) とエキソサイトーシス調査した新鮮単離の単一 RPNECs におけるクロモグラニン A 陽性を示します。RPNECs における P2X と P2Y 受容体の存在は Ca(2+) 透過性カチオン チャネルの過渡活性化と細胞外 ATP による細胞内ストアからのカルシウムの放出によってそれぞれ検証しました。アルファ、ベータ-methyleneadenosine 5 過渡対内カチオン電流が効果的にアクティブ化された '-三リン酸 (アルファ、ベータ-MeATP） と 2', 3 '-O - （2,4,6-trinitrophenyl) アデノシン 5' ブロック-三リン酸、P2X(1) または P2X(3) のサブタイプの存在を示唆します。ストアドのカルシウムのリリース ATP と UTP P2Y(2) または P2Y(4) のサブタイプの機能発現を示す均等に強力だった。P2X(1) と P2Y(2) の Mrna は RPNECs の逆のトランスクリプション PCR 解析から確認されました。アルファのアプリケーションは、ベータ版 MeATP 誘起大一過性に増加 [Ca(2+)](c)、および細胞内カルシウム店を破壊電圧アクティブ カルシウム チャンネル遮断薬によって減衰されたいないが細胞外カルシウムを省略することで廃止されました。UTP のアプリケーションの増加 [ピーク α によって誘導される Delta[Ca(2+)](c) の 55 %ca(2+)](c) ベータ MeATP。アルファのアプリケーションは、ベータ版 MeATP 炭素繊維した電流測定法とキャパシタンス測定をモニターしている RPNECs の分泌反応誘発。我々 の関心を UTP のアプリケーション アンペロ メトリック電流誘導されなかったが、純エンドサイトーシスを示す膜の静電容量を削減します。これらの結果から我々 の仮定は急激に上昇 [Ca(2+)](c) P2X を介するカルシウム流入によってはエキソサイトーシスに必須ストアド カルシウムの比較的遅い解放 RPNECs のエンドサイトーシスを誘導するのに対し。
AgRP の C 末端部分膵 β Rin5mf 細胞のカルシウム放出を介してインスリン分泌を刺激します。
アグーチ関連タンパク質 (AgRP) は、3 つの部分から構成される orexigenic ペプチッドです;アミノ酸 (N) - テルミナス、中央部、カルボキシル基 (C) - 終点。AgRP は、様々 な細胞のシグナルでは、関与しているが、各部品の正確な役割は現在明らかではないです。本研究では, インスリン分泌のため重要な AgRP のどの部分を判断しようとしました。中央部と C 末端カルシウム放出に少し影響があるに対し AgRP の C 末端が特に膵 β Rin5mf 細胞は PLC 依存的に細胞内カルシウム濃度を増加することを発見しました。このカルシウム応答新鮮単離のプライマリ ベータ細胞も観察できます。また、アンペロ メトリック測定 AgRP の C 末端エキソサイトーシス Rin5mf 細胞の率が増加することを示しています。さらに AgRP のこの地域が PLC 依存的にインスリン分泌の責任であることを示します。一緒に取られて、これらの結果は、AgRP の C 末端カルシウム放出の変調を通しての膵臓のベータ細胞のインスリン分泌に参加できることを示します。
プロテアーゼ活性化受容体 2 エキソサイトーシス膵管上皮細胞内複数シグナル伝達経路を介して増加します。
プロテアーゼ活性化受容体 2 （パー-2） はトリプシン テザー リガンドを公開するその NH(2) 末端を切断するときにアクティブ化されます。我々 は以前、パー 2 イオン チャネル膵管上皮細胞 (PDEC) をアクティブにことを証明しました。リアルタイム光蛍光プローブ シアン蛍光タンパク質 Epac1 黄色蛍光タンパク質のキャンプ、PH(PLC-delta1) 強化緑色蛍光タンパク質ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸、ため、タンパク質キナーゼ Cgamma (PKCgamma) - C1 - 黄色蛍光タンパク質のジアシルグリセ ロールを使用して、今犬 PDEC パー 2 効果を仲介するシグナル伝達経路を定義します。パー 2 アクティベーション キャンプの増加を刺激しないが、ホスホリパーゼ C イノシトール三リン酸 1,4,5 - とジアシルグリセ ロールにホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸加水分解を誘導します。1,4,5 トリスリン酸感受性カルシウム イノシトールの細胞内カルシウム動員を格納し、後続のカルシウム流入ストア作動カルシウム チャネルを通じて原因と二相性増加細胞内カルシウム濃度 ([インド 1 染付測定 Ca(2+)](i))。単一セルした電流測定法の実証は、この増加は二相性増加エキソサイトーシスでターン原因にさせた。蛋白質キナーゼのアッセイはトリプシン追加開口分泌を刺激する PKC アイソザイムをアクティブに明らかにしました。増加の開口分泌と並行して、PDEC からの粘液の分泌もトリプシンまたはパー 2 活性化ペプチドによって誘導されました。一貫性のあるパー 2 の漿膜局在は、1 microm luminal トリプシン エキソサイトーシス偏光 PDEC 単分子膜における誘導されなかった;その一方で、37 ℃ で 10 microm トリプシン上皮のバリアはそれが到達でき漿のパー 2 開口分泌を刺激するをアクティブにすること十分に損傷。したがって、PDEC でパー 2 アクティベーション増加 [させたとエキソサイトーシスと粘液の分泌を刺激する PKC をアクティブにします。これらの関数は、パー 2 膵炎の異なるモデルで報告された保護の役割仲介する可能性があります。
哺乳類松果体におけるグルタミン酸トランスポーターを介したグルタミン酸分泌。
グルタミン酸トランスポーターによるシナプス終末からリリースされたグルタミン酸をオフにその主要な役割は中枢神経系全体で表されます。ここでは、ラット pinealocytes のトランスポーターの新機能を報告します。この起電力型マイクロ トランスポーターは内向き電流 l-グルタミン酸とアスパラギンや D に応答して実施し、膜パッチ ・ クランプの実験で無偏光化しました。Ca 2 + イメージング トランスポーターを介した脱分極電位 ca 2 + チャネルを介しての大幅な ca 2 + 流入を誘導することを示した。高速液体クロマトグラフィーで炭素繊維した電流測定法により検出された ca 2 + 上昇は最終的にグルタミン酸エキソサイトーシス誘発。松果体のスライスに密集 pinealocytes とグルタミン酸から細胞を効果的にリリース隣接セル グルタミン酸トランスポーター アクティブ。KCl 脱分極またはアセチルコリンによって生成された ca 2 + シグナル伝達、再生のおかげでいくつかの細胞層「グルタミン酸性グルタミン酸放出.」したがって、我々 はグルタミン酸トランスポーター l-グルタミン酸の同期の標高とそれにより効率的にダウンレギュ レート メラトニン分泌松果体で以前に識別された抑制性代謝型グルタミン酸受容体を介して仲介することをお勧めします。
顆粒のモビリティとエキソサイトーシス Ca 2 + の制御-F アクチンの依存の形成で膵管上皮細胞。
細胞内カルシウム濃度の上昇 ([Ca(2+)](i)) トリガー膵管上皮細胞の分泌顆粒の開口放出します。この研究では, 顆粒の動きも、信号を制御することを見つけます。蛍光に分類された顆粒の運動が突然停止、[させた増加した後、速度論的 (F アクチン) 全体の細胞質のアクチン フィラメントの形成と一致します。高解像度では、新しい F アクチンの網目顆粒サイズの細胞構造がそれで物理的に閉じ込められた登場とても密だった。F-アクチン脱重合 latrunculin B と F アクチン形成と顆粒の逮捕をブロックしました。興味深いことに、全内部反射蛍光顕微鏡とを監視すると、固定化顆粒まだゆっくりと安保プラズマ膜に向かって移動。このグループの転座ミオシンのブロッカーによって廃止されました。Microamperometry による測定エキソサイトーシス示唆その密な F アクチン抑制網目エキソサイトーシスで小さなカルシウム上昇の形成 < 1 microm。大きい [させた上昇増加エキソサイトーシス コーディネート転座顆粒と膜融合のため。提案する Ca(2+) 依存凍結顆粒がうちの弱い入力フィルターしますが、エキソサイトーシス強い入力下顆粒の動きを制御することができます。
マウスの膵臓α-細胞で発現α-アミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチル-4 - Isoxazolepropionate受容体の特性と機能
膵島細胞は、ホルモンの分泌を調節するためにこのようなL-グルタミン酸などの神経伝達物質を使用しています。我々は、マウスの膵島の細胞型はイオンチャネル型グルタミン酸受容体チャネル（iGluRs）表現し、詳細な生物物理学的特性とこれらの受容体の生理的役割を記述する決定した。 iGluRs、その結果膜の脱分極を介して電流はパッチクランプ法の方法で測定した。 Ca（2 +）の電位依存性Ca（2 +）チャネルとCa（2 +）を介して流入誘発エキソサイトーシスは、Ca（2 +）のイメージングおよび炭素繊維microamperometryによって検出された。 iGluR2型グルタミン酸受容体の免疫反応性が免疫細胞化学的同定され、マウスのα-およびβ-細胞に特異的な抗体を用いて検出したのに対し、機能iGluRsは、α-細胞で検出された。細胞へのL-グルタミン酸の高速アプリケーションでは、急速に-60 mVで内向き電流を活性化し、脱感作誘発した。機能的な基準によって、電流がα-アミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチル-4 - isoxazolepropionate（AMPA）受容体として同定された。それらは活性化し、脱感作AMPAによって、およびカイニン酸によってのみ弱く活性化されたました。 AMPAによる脱感作は、チアジドによって阻害され、電流は、6 - シアノ-7 - nitroquinoxaline -2,3 - ジオン（CNQX）によってブロックされた。膵島iGluRsは、低Ca（2 +）透過性（P（カルシウム）/ P（ナ）= 0.16）と非選択性陽イオンの透過性を示した。 AMPA受容体の活性化は、α-細胞中の細胞の一連のアクション誘導される：1）27により、膜の脱分極+ / - 3 mVの、2）主に電位依存性Ca（2によって媒介される細胞内Caの上昇（2 +）+ ）チャネルは、膜の脱分極時に活性化、3）Ca（2 +）の上昇によるエキソサイトーシスの増加となりました。結論では、マウスα-細胞で発現iGluRsは、脳内の低Ca（2 +）透過性AMPA受容体に似ているとエキソサイトーシスを刺激することができます。
