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Articles by Nina Jones in JoVE
JoVE General
Adénovirus suppression génétique des molécules de signalisation dans les cultures de fibroblastes de souris embryonnaires primaires
Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph
Dans cette vidéo, nous utilisons un adénovirus porteur du gène de la recombinase Cre pour infecter les fibroblastes de souris embryonnaires primaires portant un allèle floxés Rac1.
Other articles by Nina Jones on PubMed
Un Site Unique Sur L'autophosphorylation Tie2/Tek Médiateur Dok-R Reliure Phosphotyrosine Binding Domain Et De La Fonction
Tie2/Tek est une kinase des cellules endothéliales récepteur tyrosine qui induit la transduction du signal voies impliquées dans la migration cellulaire sur l'angiopoïétine-1 (Ang1) la stimulation. Pour faire face à l'importance des divers résidus tyrosine de Tie2 dans la transduction du signal, nous avons généré une série de Tie2 mutants et examiné leurs propriétés de signalisation. Utilisation cette approche en conjonction avec un état de phosphorylation-anticorps spécifique, on identifié résidu tyrosine 1106 sur Tie2 en tant que site d'autophosphorylation Ang1-dépendante qui assure la médiation de liaison et la phosphorylation de l'aval de la kinase-liée (Dok-R) de protéine d'accostage. Ce résidu tyrosine est contenue dans un motif d'interaction unique pour le domaine de liaison phosphotyrosine de Dok-R, et le domaine d'homologie pleckstrine de Dok-R contribue en outre à Tie2 obligatoire dans un phosphatidylinositol 3'-kinase-dépendante. Introduction d'un mutant Tie2 manque résidu tyrosine 1106 dans les cellules endothéliales interfère avec Dok-R phosphorylation en réponse à Ang1. En outre, ce mutant est incapable de restaurer le potentiel de migration des cellules endothéliales provenant de souris dépourvues de Tie2. Ensemble, ces résultats montrent que les résidus de tyrosine 1106 sur Tie2 est essentiel pour le couplage en aval des voies de migration des cellules de transduction du signal avec la stimulation Ang1 dans les cellules endothéliales.
Transgénique ARN Interférence Dans Récapitule La ES Embryons De Cellules Dérivées D'un Phénotype Null Génétique
Le ciblage génique par recombinaison homologue dans souches embryonnaires murines (ES) des cellules a été la méthode de choix pour déchiffrer la fonction des gènes in vivo chez les mammifères. Malgré des améliorations dans cette technologie, il reste encore une méthode laborieuse. Les progrès récents dans l'interférence ARN (ARNi) la technologie ont fourni un rapide perte de fonction de méthode pour évaluer la fonction des gènes dans un certain nombre d'organismes. Des études dans des lignées cellulaires de mammifères ont montré que l'introduction de petits ARN interférents (siRNA) des molécules d'ARN sert d'intermédiaire efficace silence. Plasmide à base de systèmes utilisant l'ARN polymérase III (ARN pol III) les promoteurs à courte distance en voiture en épingle à cheveux d'ARN (shRNA) ont été mis en place pour produire de manière stable siARN. Ici, nous rapportons la génération de lignées de cellules ES avec knockdown transgénique shRNA. En raison de la nature dominante de l'effet de choc, les phénotypes embryonnaires pouvaient être directement évalués dans des embryons de complètement dérivées de cellules ES par la méthode d'agrégation tétraploïde. Ces embryons, dans lequel endogène p120-Ras GTPase-activating protein (RasGAP), codée par RASA1 (également connu sous le nom RasGAP), a été réduit au silence, a eu le même phénotype que fait le précédemment rapporté RASA1 mutation nulle.
Actions Angiogéniques De L'angiopoïétine-1 Exiger Dérivé De L'endothélium D'oxyde Nitrique
Angiopoietin1 (Ang1) est un nouveau facteur angiogénique avec des actions importantes sur des cellules endothéliales (CE) différenciation et la maturation vasculaire. Ang1 a été montré pour empêcher l'apoptose via l'activation de CE PI3-kinase/Akt, une voie qui est également connu pour activer l'oxyde nitrique synthase endothéliale (eNOS). Par conséquent, nous avons supposé que les effets angiogéniques de Ang1 serait également dépendante de la voie PI3-kinase/Akt, éventuellement médiée par une activité accrue et eNOS la libération de NO. Traitement des cellules humaines endothéliales de veine ombilicale avec Ang1 recombinant * (300 ng / ml) pendant 15 minutes a entraîné la PI3-kinase dépendante de la phosphorylation de Akt, comparable à celle observée avec le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) (50 ng / ml), et la production de NO augmenté d'une manière PI3-kinase/Akt-dependent. La formation du tube capillaire de type induite par Ang1 * dans la matrice de fibrine à 24 heures (indice de différenciation, DI: 13,74 + / - 0,76 par rapport au contrôle 1.71 + / - 0,31) a été aboli en présence de la PI3-kinase sélectif inhibiteur LY294002 (50 micro mol / L) (DI: 0,31 + / - 0,31, P <0,01) ou l'inhibiteur de NOS, le L-NAME (3 mmol / L) (DI: 4.10 + / - 0,59, P <0,01). Dans les implants sous-cutanés Matrigel in vivo, l'ajout de recombinant * Ang1 ou de type sauvage Ang1 de milieux conditionnés de cellules COS-1 transfectées avec un vecteur d'expression pFLAG Ang1, induit une néovascularisation importante à un degré similaire au VEGF. Enfin, l'angiogenèse in vivo en réponse à la fois Ang1 et le VEGF était significativement réduite dans eNOS-déficient par rapport à souris de type sauvage. En résumé, nos résultats démontrent pour la première fois que l'endothélium dérivé NO est nécessaire pour Ang1 l'angiogenèse induite par, et que les médiatise la PI3-kinase de signalisation de l'activation de eNOS et de la libération de NO en réponse à Ang1.
Des Mutations Ciblées Des Tyrosines Juxtamembranaire Dans La Tyrosine Kinase Kit Récepteur Affectent Sélectivement Lignées Cellulaires Multiples
Perte de fonction des mutations dans le murin dominante des taches blanches / c-kit locus affectent un large éventail de processus biologiques et des lignages cellulaires et provoquer toute une gamme de phénotypes, y compris une anémie sévère, défectueux pigmentation, la stérilité, les déficits des mastocytes, un manque de cellules interstitielles de Cajal, spatiales déficits de la mémoire d'apprentissage, et des défauts dans la régénération des nerfs périphériques. Ici, nous montrons que les résidus tyrosine 567 et 569 dans le juxtamembranaire (Jx) domaine de la tyrosine kinase Kit récepteur murin sont cruciaux pour la fonction de kit dans la mélanogénèse et le développement des mastocytes, mais ne sont pas indispensables pour le développement normal des cellules érythroïdes, les cellules interstitielles de Cajal et les cellules germinales. En outre, les souris adultes qui n'ont pas les deux tyrosines présentent une splénomégalie, dysrégulation des cellules B et le développement des mégacaryocytes, et les estomacs dilatés. Analyse des événements de transduction du signal induit par les récepteurs mutants après stimulation ligand indique que des mutations Jx tyrosine diminue l'autophosphorylation du récepteur et de manière sélective atténuer l'activation de extracellular signal-regulated kinase / protéines kinases activées par les mitogènes. Ensemble, ces observations démontrent que le domaine de Jx Kit joue un rôle de cellule de type réglementaire spécifique in vivo et d'illustrer comment les mutations d'ingénierie en kit peut être utilisé pour comprendre les événements complexes biologiques et moléculaires qui résultent de l'activation d'un récepteur tyrosine kinase.
Une Cyclosporine Sensible Psoriasis-comme La Maladie De Produit En Tie2 Souris Transgéniques
Le psoriasis est une commune, maladie de la peau persistante caractérisée par des lésions érythémateuses récurrents censés résulter de l'infiltration de cellules inflammatoires et l'activation de la prolifération des kératinocytes. Non programmé angiogénique la croissance a également été proposé à la médiation de la pathogenèse du psoriasis, bien que la base cellulaire et moléculaire pour cette réponse reste floue. Récemment, un rôle pour le système de signalisation angiopoïétine dans le psoriasis a été suggéré par des études qui démontrent une régulation positive de la tyrosine kinase du récepteur Tie-2 (également connue sous le nom Tek) ainsi que l'angiopoïétine-1 et l'angiopoïétine-2 dans l'homme des lésions psoriasiques. Pour examiner l'expression temporelle de Tie2, nous avons développé une approche binaire transgénique sorte que l'expression de Tie2 peuvent être conditionnellement réglementée par la présence d'analogues de tétracycline en double-souris transgéniques. Un phénotype psoriasis comme développé en double-transgéniques animaux dans les 5 jours de la naissance et l'âge adulte persisté tout au long. La peau des souris affectées présentaient de nombreuses caractéristiques cardinales de psoriasis humaine, y compris une hyperplasie épidermique, l'accumulation de cellules inflammatoires, et une altération de l'angiogenèse par voie cutanée. Ces anomalies de la peau complètement résolue avec la tétracycline médiée par la suppression de l'expression du transgène, illustrant ainsi une dépendance complète sur Tie2 de signalisation pour la maintenance et la progression des maladies. En outre, les lésions de la peau en double-souris transgéniques nettement amélioré après l'administration de la cyclosporine agent anti-psoriasique immunosuppresseur, démontrant ainsi la signification clinique de ce nouveau modèle.
Rôle Sélective D'un Résidu Tyrosine Distinct Sur Tie2 Dans Le Développement Du Cœur Et Hématopoïèse Précoce
Le développement du système cardio-vasculaire et le développement des premiers systèmes hématopoïétiques sont étroitement liées, et les deux nécessitent la signalisation par le récepteur à activité tyrosine kinase Tie2. Bien que les cellules endothéliales et les cellules hématopoïétiques ainsi que de leurs précurseurs ont en commun l'expression des gènes au cours du développement, il reste totalement inconnu comment Tie2 signalisation réglemente de manière coordonnée le développement cardiovasculaire et l'hématopoïèse précoce in vivo. Nous montrons ici que les souris avec une mutation ciblée dans les résidus de tyrosine 1100 dans la queue carboxy-terminal de Tie2 afficher un défaut de développement cardiaque et des troubles de développement des cellules hématopoïétiques et endothéliales dans le mésoderme para-aortiques splanchnopleural similaire à celle observée dans Tie2-souris mutantes nulles. Étonnamment, toutefois, contrairement à Tie2-souris mutantes nulles, les souris déficientes en signalisation à travers ce résidu tyrosine montrent une association normale des cellules périvasculaires des vaisseaux sanguins naissants. Ces études sont les premiers à démontrer l'importance physiologique d'un seul résidu tyrosine dans Tie2, et ils suggèrent que plusieurs résidus tyrosine du récepteur peut coordonner le développement cardiovasculaire et au début du développement hématopoïétique.
Protéines Adaptateur NCK Lien Néphrine à L'cytosquelette D'actine Des Podocytes Rénaux
La barrière de filtration glomérulaire du rein est formée en partie par une jonction spécialisée intercellulaire appelé le diaphragme à fente, qui relie les pieds adjacents processus actine à base de cellules rénales épithéliales podocytes). Les mutations qui affectent un certain nombre de protéines diaphragme à fente, y compris néphrine (codée par NPHS1), conduire à une maladie rénale en raison de la perturbation de la barrière de filtration et le réarrangement du cytosquelette d'actine, bien que la base moléculaire de la ce n'est pas clair. Ici, nous montrons que la néphrine se lie sélectivement l'homologie Src 2 (SH2) / SH3 de domaine contenant des protéines adaptatrices NCK, qui à son tour contrôler le cytosquelette podocyte in vivo. La queue cytoplasmique de la néphrine a plusieurs sites YDxV qui forment des motifs de liaison préféré pour le domaine SH2 Nck fois phosphorylée par la Src kinases de la famille-. Nous montrons que cette interaction Nck-néphrine est nécessaire pour réorganisation de l'actine néphrine-dépendante. Suppression sélective de Nck de podocytes de souris transgéniques résultats dans les défauts de la formation de processus de pied et dans le syndrome néphrotique congénital. Ensemble, ces résultats permettent d'identifier une voie de signalisation physiologique dans lequel néphrine est lié par la phosphotyrosine interactions basées sur des adaptateurs NCK, et donc de le cytosquelette d'actine sous-jacent dans les podocytes. Simples et largement exprimé SH2/SH3 protéines adaptateur peut donc diriger la formation d'une morphologie cellulaire in vivo spécialisée.
Dépistage Pour Les Partenaires Du Domaine PTB Liaison Et La Spécificité Du Ligand à L'aide Du Protéome Dérivés Peptidiques Tableaux NPXY
Domaines d'interaction modulaires qui reconnaissent des motifs peptidiques dans les protéines cibles peut donner la sélectivité dans les voies de signalisation. Phosphotyrosine contraignantes (PTB) domaines sont des composants des protéines cytoplasmiques qui se lient d'accueil récepteurs de surface cellulaire par le biais des motifs NPXY. Nous avons utilisé une bibliothèque de séquences de l'homme NXXY protéome dérivés d'explorer la spécificité du domaine PTB et de la fonction. Tableaux SPOTS peptidiques ont été utilisés pour créer une matrice complète de motifs récepteurs qui ont été sondés avec un ensemble de 10 domaines PTB diverses. Cette approche a confirmé que les domaines PTB individuels ont des propriétés de reconnaissance sélective et distincte et a fourni un moyen d'explorer plus de 2500 potentiels PTB domaine NXXY interactions. Les résultats sont en bonne corrélation avec les associations déjà connues entre les protéines pleine longueur et prédit de nouvelles interactions, ainsi que des données de consensus de liaison pour les domaines PTB spécifiques. Utilisation de la Ret, MuSK, et ErbB2 récepteurs tyrosine kinases, nous montrons que les interactions de ces récepteurs avec des domaines PTB prédit de se lier par des tableaux NXXY ne se produisent dans les cellules. Tableaux peptidiques Proteome base peut donc identifier les réseaux d'interactions avec les protéines d'échafaudage des récepteurs qui peuvent être physiologiquement pertinent.
Analyse D'une Protéine De La Famille Adaptateur Shc, ShcD/Shc4, Qui S'associe à Muscle-kinase Spécifique
Protéines de la famille Shc servir molécules adaptatrices phosphotyrosine dans différents médiés par les récepteurs des voies de signalisation. Chez les mammifères, trois gènes distincts Shc ont été décrits qui codent des protéines caractérisées par deux phosphotyrosine interaction modules, un amino-terminal de liaison phosphotyrosine (PTB) de domaine et un carboxy-terminale du domaine Src homology 2. Ici, nous rapportons l'analyse d'une protéine non caractérisée quatrième famille Shc, ShcD/Shc4, qui est exprimé dans le cerveau adulte et le muscle squelettique. Conformément à ce modèle d'expression, nous constatons que SHCD peut associer via son domaine PTB avec le phosphorylée spécifique du muscle kinase (MuSK) récepteur tyrosine kinase et subissent aval phosphorylation sur tyrosine de MuSK activé. Il est intéressant, d'autres sites de phosphorylation sur tyrosine, y compris un roman du site de liaison Grb2, sont présents sur SHCD qui ne sont pas trouvées dans d'autres protéines de la famille Shc. L'activation de MuSK sur agrine contraignant lors de la jonction neuromusculaire (JNM) induit le regroupement et la phosphorylation sur tyrosine de récepteurs de l'acétylcholine (AchR) nécessaires à la transmission synaptique. SHCD est co-exprimé avec MuSK dans la région post-synaptique de la jonction neuromusculaire, et dans les myotubes en culture stimulés par l'agrine, l'expression de la SHCD semble être important pour la phosphorylation sur tyrosine début de la CADH. Ainsi, nous avons caractérisé un nouveau membre de la famille des protéines Shc stations d'accueil, qui peuvent médier un aspect spécifique de la signalisation en aval du récepteur MuSK.
Phosphorylés Motifs YDXV Et NCK SH2/SH3 Adaptateurs Agir En Coopération Pour Induire Réorganisation De L'actine
Nous avons analysé les moyens par lesquels la famille des protéines Nck protéines adaptatrices couples d'adhésion à réorganisation de l'actine. La protéine d'adhésion néphrine est essentiel pour la formation des processus basés sur pied d'actine dans les podocytes glomérulaires. Le regroupement des néphrine induit sa phosphorylation sur tyrosine, le recrutement Nck, et soutenue polymérisation de l'actine localisée. Toute l'un des trois motifs phosphorylés YDXV (P) sur la néphrine est suffisante pour recruter Nck par son homologie Src 2 (SH2) de domaine et d'induire polymérisation de l'actine localisée dans ces pôles. De même, NCK SH3 mutants dans lesquels seul le deuxième ou troisième domaine SH3 est fonctionnelle peut servir de médiateur polymérisation de l'actine induite par la néphrine. Cependant, la combinaison néphrine tels mutants et NCK atténue polymérisation de l'actine au néphrine-NCK grappes. Nous proposons que les multiples NCK SH2 motifs de liaison sur la néphrine et les multiples domaines SH3 de Nck acte en collaboration pour recruter la forte concentration locale des effecteurs sur les sites d'activation néphrine qui est requis pour initier et maintenir polymérisation de l'actine in vivo. Nous constatons également que les motifs YDXV dans la protéine Tir d'Escherichia coli entéropathogènes et néphrine sont fonctionnellement interchangeables, ce qui indique que Tir réorganise le cytosquelette d'actine par mimétisme moléculaire de néphrine-comme signalisation. Ensemble, ces données identifient pYDXV / NCK de signalisation comme un mécanisme puissant et portable pour la régulation physiologique et pathologique actine.
Protéines NCK Maintenir La Barrière Glomérulaire Adultes De Filtration
Dans le glomérule, la protéine néphrine échafaudage relie les processus de pied actine-riches qui s'étendent à partir podocytes adjacents pour former le diaphragme à fente. Les mutations qui affectent un certain nombre de protéines diaphragme à fente, y compris la néphrine, provoquer une maladie glomérulaire par réarrangement du cytosquelette d'actine et la perturbation de la barrière de filtration. Nous avons récemment établi que la famille Nck de Src homology 2 (SH2) / SH3 des protéines adaptatrices du cytosquelette peut servir de médiateur réorganisation de l'actine néphrine-dépendante. Formation des processus pied nécessite l'expression de Nck dans le développement de podocytes, mais il ne sait pas si Nck maintient la structure et la fonction podocyte long de la vie. Ici, nous avons utilisé une stratégie inductible transgénique de supprimer l'expression dans les podocytes de souris Nck adultes et constaté que la perte d'expression Nck a rapidement conduit à une protéinurie, la glomérulosclérose, et la morphologie altérée des processus pieds. Nous avons également constaté que la blessure podocyte réduit la phosphorylation de la néphrine dans les reins adultes. Ces données suggèrent que Nck est nécessaire pour maintenir les podocytes adultes et que les interactions phosphotyrosine-base avec néphrine peut se produire dans les processus de pieds de repos, les podocytes matures.
Profils D'expression De La SHCD Et Shc Protéines Adaptateur Famille Pendant Embryonnaire De La Souris De Développement
Le homologie Src et le collagène (SHC) les protéines fonctionnent comme des adaptateurs moléculaires dans les voies de signalisation médiées par une variété de récepteurs de surface cellulaire. Parmi les quatre mammifères protéines Shc, SHCD est le moins caractérisé. À cette fin, l'expression SHCD a été documentée et comparée à celle d'autres protéines de la famille Shc. Dans l'embryon de souris en développement, l'expression de chevauchements SHCD avec celle d'autres protéines Shc dans le système nerveux central, avec une distribution spécifique dans les neurones post-mitotiques. En outre, robuste expression SHCD est vu dans les cellules épithéliales différenciées de plusieurs organes, ainsi que dans le muscle squelettique et cardiaque, et des tissus divers d'origine de la crête neurale. Fait intéressant, tous les membres de la famille Shc sont exprimés en chondrocytes hypertrophiques, le premier rapport de l'expression des protéines Shc dans le squelette en développement. Les modèles uniques de distribution tissulaire des protéines Shc susceptibles de contribuer à leurs complexes tissu-spécifiques des fonctions de signalisation lors de l'embryogenèse.
Le SHCA Phosphotyrosine Accueil Protéines Utilise Des Mécanismes Distincts Pour Réguler La Fonction Cardiaque Des Myocytes Et Global
Bien que les tyrosine kinases (TKS) sont importantes pour la fonction cardiaque, de leurs objectifs pertinents en aval dans le cœur des adultes ne sont pas connus. La protéine se lie d'accueil SHCA spécifiques phosphotyrosine (pTyr) des sites à TKS activés grâce à son extrémité N-terminale pTyr contraignant (PTB) et C-terminales domaines SH2 et stimule les voies en aval par le biais des motifs tels que des sites pTyr dans sa région centrale CH1. Par conséquent, SHCA pourrait être un pivot potentiel pour les savoirs traditionnels en aval de signalisation dans le myocarde.
Trans-interaction De La Néphrine Et Neph1/Neph3 Induit L'adhésion Cellulaire Qui S'associe Avec La Phosphorylation Sur Tyrosine De La Diminution De La Néphrine
Diaphragmes à fente sont des jonctions spécialisées entre les cellules épithéliales glomérulaires (podocytes) qui sont cruciaux pour l'ultrafiltration glomérulaire. La superfamille des Ig membres néphrine et Neph1 sont des composantes essentielles du diaphragme à fente, tandis que le rôle de Neph1 homologue Neph3 dans le diaphragme à fente est inconnue. Dans le présent document, nous montrons que Neph3 homodimerizes et s'hétérodimérise avec néphrine et Neph1. Nous avons en outre cherché à savoir si ces interactions jouent un rôle dans l'adhésion cellulaire à l'aide de fibroblastes de souris L qui n'ont pas endogène d'adhésion cellulaire et a constaté que l'activité Neph1 et Neph3 sont capables d'induire l'adhésion cellulaire seule, alors que la néphrine doit trans-interagir avec Neph1 ou Neph3 dans pour favoriser la formation de cellule-cellule contacts. Phosphorylation sur tyrosine de la néphrine était régulée à la baisse après néphrine trans-interagi avec soit Neph1 ou Neph3 conduisant à la formation de la cellule-cellule contacts. Nous avons également constaté que l'expression de Neph3 a été augmenté dans les podocytes de souris déficientes en néphrine. Les conclusions de la présent document que la néphrine et Neph1 ou Neph3 trans-interactions de promouvoir des cellules de contact la formation, ce qui suggère qu'ils peuvent également fonctionner ensemble dans l'assemblage diaphragme à fente.
L'activation De RhoA Dans Les Podocytes Induit Glomérulosclérose Segmentaire Et Focale
Une bonne organisation du cytosquelette d'actine est essentielle pour la structure et la fonction normales des podocytes. RhoA module dynamique de l'actine, mais son rôle dans la biologie podocyte est controversée. Ici, nous avons généré des souris transgéniques qui expriment une forme constitutivement active de RhoA d'une manière spécifique et podocyte-doxycycline-inductible. Induction de l'actif RhoA avec la doxycycline a entraîné l'albuminurie significative. En outre, à la fois le degré de l'albuminurie et les modifications histologiques dans le glomérule positivement corrélée avec le niveau d'expression de RhoA constitutivement active: de faibles niveaux d'expression associés à segmentaire pieds processus effacement sans changements observables par microscopie optique, tandis que des niveaux plus élevés d'expression associée à à la fois vaste pieds processus d'effacement et des caractéristiques histologiques de glomérulosclérose segmentaire et focale (HSF). En outre, l'induction de l'actif RhoA nettement régulés à la hausse l'expression des ARNm glomérulaire de fibronectine et du collagène IA1, et le degré de régulation à la hausse en corrélation positive avec le niveau de l'albuminurie. Retrait de la doxycycline a conduit à une baisse de l'albuminurie vers des niveaux de base dans la plupart des souris, mais lourd albuminurie persistait chez certaines souris. Pris dans leur ensemble, ces données suggèrent que l'activation de RhoA dans les podocytes conduit à l'albuminurie accompagnée par une série de modifications histologiques caractéristiques de la maladie entraînant des changements minimes et FSGS chez les humains. Bien que la plupart des changements sont réversibles, grave et prolongée d'activation de RhoA peut causer glomérulosclérose irréversible.
Protéines Podocyte, Néphrine, Est Un Substrat De Protéine Tyrosine Phosphatase 1B
Podocytes glomérulaires sont essentielles pour la fonction de barrière du glomérule dans le rein et leur dysfonctionnement provoque une fuite de protéines dans l'urine (protéinurie). Néphrine est une protéine clé podocyte, qui réglemente le cytosquelette d'actine via la phosphorylation sur tyrosine de son domaine cytoplasmique. Nous rapportons ici que deux protéines tyrosine phosphatases, les PTP1B et PTP-PEST réguler négativement la phosphorylation sur tyrosine néphrine. PTP1B et se lie directement à déphosphoryle néphrine, tandis que l'action de la PTP-PEST est indirecte. Les deux phosphatases sont également surexprimée dans le glomérule dans le modèle de rat de puromycine aminonucléoside néphrose. Les deux surexpression et l'inhibition de PTP1B dérangé le cytosquelette d'actine dans les podocytes de souris en culture. Ainsi, protéines tyrosine phosphatases peut affecter la fonction de régulation par l'intermédiaire podocyte néphrine phosphorylation sur tyrosine.
Notch Favorise Dynamin L'endocytose Dépendante De La Néphrine
Signalisation Notch dans les podocytes provoque la protéinurie et glomérulosclérose chez les humains et les rongeurs, mais le mécanisme sous-jacent demeure inconnu. Ici, nous avons analysé les événements morphologiques, moléculaires et cellulaires avant l'apparition de la protéinurie chez le nouveau-souris transgéniques qui expriment Notch activé dans les podocytes. Immunohistochimie a révélé une perte de la protéine Slit néphrine membrane exclusivement dans les podocytes exprimant Notch activé. Podocyte spécifique suppression de Rbpj, ce qui est essentiel pour la signalisation Notch canonique, empêché cette perte de néphrine. La surexpression de Notch activé diminué néphrine surface de la cellule et une augmentation néphrine cytoplasmique dans les cellules transfectées HEK293T; inhibition pharmacologique de la dynamine, mais pas l'épuisement de cholestérol, bloqué ces effets sur la néphrine, ce qui suggère que Notch favorise la dynamine-dépendante, raft-indépendante de l'endocytose néphrine. Soutenir une association entre la signalisation Notch et le trafic néphrine, la microscopie électronique a révélé raccourcis processus pieds podocyte et les diaphragmes de fente moins chez les souris transgéniques par rapport aux contrôles. Ces données suggèrent que la signalisation Notch induit l'endocytose de la néphrine, déclenchant ainsi l'apparition d'une protéinurie.
Substitutions Proline Et Pseudophosphorylation Thréonine Du Ligand SH3 De 18,5 KDa Myelin Basic Protein Diminuer Son Affinité Pour Le Domaine SH3-Fyn Et Alter Développement De Procédés Et La Localisation Des Protéines Dans Les Oligodendrocytes
Les protéines de myéline de base régulés par le développement (Mbps), qui découlent de la Golli (gène de la lignée des oligodendrocytes) complexe, sont fortement chargée positivement, intrinsèquement désordonnées, des protéines multifonctionnelles ayant plusieurs isoformes d'épissage alternatif et des modifications post-traductionnelles, et ils jouent un rôle clé dans la compaction de myéline . Le classique 18,5 kDa MBP isoforme a une région riche en proline comprenant les acides aminés 92-99 (murin séquence-T (92) PRTPPPS (99) -), qui contient une minimale domaine SH3 ligand. Nous avons précédemment montré que 18,5 kDa se lie à plusieurs MBP domaines SH3, y compris celle de Fyn, un membre de la famille Src de tyrosine kinases impliquées dans un certain nombre de voies de signalisation au cours du développement du SNC. Pour déterminer le rôle physiologique de cette liaison, ainsi que le rôle de la phosphorylation de la Thr92 et Thr95, dans l'étude actuelle, nous avons produit des variantes MBP plusieurs ciblant spécifiquement les sites de phosphorylation et les principales régions structurelles de domaine MBP ligand SH3. Utilisation de la calorimétrie à titration isotherme, nous avons démontré que, comparativement à la protéine de type sauvage, ces variantes ont une plus faible affinité pour le domaine SH3 de Fionie. En outre, la surexpression de versions GFP N-terminal-étiquetés dans immortalisé oligodendrogliale N19 et N20.1 cultures cellulaires en résulte un allongement anormal des procédés membranaires et une augmentation de branchement complexité et inhibe la capacité de MBP pour diminuer Ca (2 +) afflux. La phosphorylation de la Thr92 peut également causer des MBP à la circulation vers le noyau, où il peut participer à d'autres interactions protéine-protéine. La coexpression de MBP avec une forme constitutivement active de Fyn kinase abouti à l'élaboration procédé à membrane, un phénomène qui a été aboli par points des substitutions d'acides aminés du domaine MBP ligand SH3. Ces résultats suggèrent que le domaine MBP ligand SH3 joue un rôle clé dans les interactions entre protéines intracellulaires in vivo et peuvent être nécessaires à l'élaboration membrane propre des oligodendrocytes en développement et, en outre, que la phosphorylation de Thr92 et Thr95 pouvez régler cette fonction.
