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Articles by Patricia Lam in JoVE
JoVE General
L'uso di Arabidopsis Mutanti eceriferum da esplorare per cuticole Biosintesi impianto
1Department of Botany, University of British Columbia - UBC, 2Department of Chemistry, University of British Columbia - UBC
La cuticola pianta è un rivestimento ceroso esterno sulle piante che ha un ruolo primario nella conservazione dell'acqua, ma è anche un importante barriera contro l'ingresso di microrganismi patogeni. In questo video, si dimostra l'analisi dei mutanti cuticola piante identificate da marcia avanti e retromarcia approcci genetica.
Other articles by Patricia Lam on PubMed
CER4 Codifica Un Formando Alcol Grasso Acil-coenzima A Reduttasi Coinvolti Nella Produzione Di Cere Cuticolari in Arabidopsis
Una cuticola cerosa che serve come una barriera protettiva contro la perdita d'acqua incontrollata e cappotti di danno ambientale le superfici aeree delle piante terrestri. Esso è composto da una matrice polimerica di cutina e cere. Cere cuticolari sono miscele complesse di molto-lungo-catena acidi grassi e loro derivati. Riportiamo qui la clonazione molecolare e la caratterizzazione di CER4, un gene biosintetico cera da Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). Mutanti di Arabidopsis cer4 esibiscono grandi diminuzioni nel gambo alcoli primari ed esteri di cera e leggermente elevati livelli di aldeidi, alcani, alcoli secondari e chetoni. Questo fenotipo ha suggerito che CER4 codificato un formando alcol grasso acil-coenzima A reduttasi (FAR). Abbiamo individuato otto geni estremo-come in Arabidopsis che sono altamente correlati ad un alcool-formando finora espressa in semi di jojoba (Simmondsia chinensis). Caratterizzazione molecolare di alleli CER4 e complementazione genomico ha rivelato che uno di questi otto geni, At4g33790, codificato l'estremo necessaria per la produzione di cere cuticolari. Espressione di cDNA CER4 nel lievito (Saccharomyces cerevisiae) ha provocato l'accumulo di C24:0 e alcoli di C26:0 primari. Completamente funzionale proteina fluorescente verde messo proteine CER4 era localizzata al reticolo endoplasmatico in cellule di lievito da microscopia confocal. Analisi dell'espressione genica mediante PCR-trascrizione inversa indicano che CER4 è stato espresso in foglie, steli, fiori, silique e radici. Espressione di un gene reporter beta-glucuronidasi guidato dal promotore CER4 in piante transgeniche è stato rilevato in cellule epidermiche di foglie e steli, coerenti con un ruolo dedicato per CER4 nella biosintesi di cere cuticolari. CER4 è stato espresso anche in tutti i tipi di cellule nella zona di allungamento delle giovani radici. Questi dati indicano che CER4 è un alcool formando estremo che ha specificità per molto-lungo-catena acidi grassi ed è responsabile per la sintesi di alcoli primari nelle cellule epidermiche di tessuti aerei e nelle radici.
Una Subunità Di Nucleo Del RNA-elaborazione/degradazione Exosome Influenza Specificamente Biosintesi Cuticolari Cera in Arabidopsis
La cuticola è una matrice extracellulare composta da poliestere cutina e cere che copre gli organi aerei delle piante terrestri e li protegge da sollecitazioni ambientali. Il mutante di Arabidopsis thaliana cer7 esibisce cere cuticolari ridotto accumulo e contiene considerevolmente più bassi livelli di trascrizione di ECERIFERUM3/WAX2/un tempo-un tempo (CER3, WAX2, YRE), un gene biosintetico chiave cera. Mostriamo qui che CER7 proteina è un putativo 3' -5 ' esoribonucleasi omologa al lievito ribonucleasi PH45 (RRP45p), una subunità di nucleo del RNA processing e degradante exosome che controlla l'espressione di CER3/WAX2/YRE. Proponiamo che CER7 agisce degradando una particolare specie di mRNA che codifica un regolatore negativo della trascrizione di CER3/WAX2/YRE. Un secondo omologo RRP45p trovato in Arabidopsis, indicato a RRP45a, è parzialmente funzionalmente ridondante con CER7 e perdita completa della funzione RRP45 in Arabidopsis è letale. A nostra conoscenza, CER7 è attualmente l'unico esempio di una subunità exosomal core specificatamente influenzare un processo cellulare.
Attivazione Dei Recettori TRPV1 Umani Ricombinanti Espresso in Cellule Di Neuroblastoma Umano SH-SY5Y Aumenti [Ca(2+)](i), Avvia Il Rilascio Di Neurotrasmettitore E Promuove La Morte Cellulare Ritardata
Sottotipo dei recettori vanilloidi di (TRP) potenziale transient receptor 1 (TRPV1) è un canale ionico ligand-gated, Ca(2+)-permeabile nella superfamiglia dei canali TRP. Segnaliamo l'istituzione del primo modello neuronale esprimendo TRPV1 umana ricombinante (SH-SY5Y(hTRPV1)). Cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y sono state stabilmente transfected con hTRPV1 usando il Amaxa Biosystem (hTRPV1 in pIREShyg2 con hygromycin selezione). Capsaicina, olvanil, resiniferatoxin e l'endocannabinoide anandamide aumentata [Ca(2+)](i) con potenza (valori EC(50)) 2,9 nmol/L, 34,7 nmol/L, 0.9 nmol/L e 4,6 micromol/L, rispettivamente. Il endovanilloid putativo N-arachidonoil-dopamina aumentata [Ca(2+)](i) ma questa risposta non ha raggiunto un massimo. Capsaicina, anandamide, resiniferatoxin e olvanil mediata aumenti [Ca(2+)](i) sono stati inibiti dai capsazepine antagonisti TRPV1 e iodo-resiniferatoxin con potenze (K(B)) di circa 70 nmol/L e 2 nmol/L, rispettivamente. Capsaicina stimola il rilascio di noradrenalina [3 H] pre-labelled da monostrati di cellule SH-SY5Y(hTRPV1) con un EC(50) di 0,6 nmol/L che indica amplificazione tra [Ca(2+)](i) e rilascio. In un sistema di perfusione, abbiamo misurato simultaneamente il rilascio di noradrenalina [3 H] e [Ca(2+)](i) e osservato che maggiore [Ca(2+)](i) preceduto trasmettitore. rilasciare Trattamento di capsaicina produsse anche una risposta citotossica (155 EC(50) nmol/L) che fu antagonista-sensibili e specchia [Ca(2+)](I) risposta. Questo modello viene visualizzato farmacologia coerenza con TRPV1 heterologously espressa in cellule non-neuronali standard e culture native neuronale. Il vantaggio di SH-SY5Y(hTRPV1) è la capacità di hTRPV1 di coppia per macchine biochimiche neuronali e produrre grandi quantità di cellule.
Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry Metodo Per La Misurazione Di Anandamide Nel Plasma Umano
Anandamide (N-arachidonoylethanolamine, AEA) è un endocannabinoide presenti nel plasma umano associato a diverse funzioni fisiologiche e Stati di malattia. Significativa variabilità nelle concentrazioni plasmatiche AEA è stata segnalata tra gli studi, poiché la quantificazione dell'AEA è irto di difficoltà metodologiche. Un metodo di rapida, altamente sensibile, robusto, specifiche e altamente riproducibile ultra high performance liquid chromatography-tandem spettrometria di massa (UPLC-MS/MS) è descritto qui per l'analisi di AEA nel plasma umano. Questo metodo completamente convalidato utilizzando octa-deuterated AEA (AEA-d8) come standard interno rappresenta un miglioramento rispetto a precedenti analisi in termini di fase di esecuzione (4 min), limite di rilevazione (0.055 fmol su colonna, 18,75 fmol/ml di plasma), precisione (deviazioni standard relative di 3,7 3,9 e 4,8% per 1.66, 6.65 e 133 fmol sulla colonna) e precisione (97,5-104,5%). AEA analisi era lineare sopra la gamma 0,23 a 19 nM (1.66 a 133 fmol sulla colonna). Per dimostrare l'utilità di questo metodo per la misurazione dei livelli di AEA in campioni clinici, i campioni di plasma ottenuti da volontari femminile nelle diverse fasi del ciclo mestruale e le donne incinte sono state analizzate. Le concentrazioni plasmatiche AEA erano significativamente (P = 0.0078) più bassa nella fase luteale del ciclo mestruale rispetto alla fase follicolare. In gravidanza, le concentrazioni sono state più basse del primo e secondo trimestre con livelli paragonabili a quelli osservati nella fase luteale del ciclo mestruale e modestamente aumentato nel terzo trimestre. I più alti livelli plasmatici di AEA sono stati osservati in donne in attivo del lavoro, e questi erano significativamente (P = 0.0147) superiori a quelli osservati nelle donne al termine, ma non nel lavoro attivo. Nelle donne in postmenopausa ha avuto concentrazioni AEA paragonabile ai livelli osservati durante la fase luteale di donne in premenopausa ed erano significativamente (P = 0.0389) inferiore a concentrazioni plasmatiche AEA ottenute durante la fase follicolare. La sensibilità e la precisione del metodo convalidato descritto qui suggerisce che questo metodo è adatto per l'analisi dell'AEA in campioni clinici e può essere utilizzato per l'indagine biomatrices che contiene una quantità limitata di AEA.
Identificazione Della Cera Ester Sintasi/acil-coenzima R: Diacilglicerolo Aciltransferasi WSD1 Necessaria Per La Biosintesi Di Ester Staminali Cera in Arabidopsis
Esteri di cera sono lipidi neutri composte da acidi, con entrambi moiety solitamente lunga catena e gli alcoli alifatici (C(16) e C(18)) o catena molto lunga (C(20) e più a lungo) strutture di carbonio. Hanno diverse funzioni biologiche in batteri, insetti, mammiferi e piante terrestri e sono anche substrati importanti per una varietà di applicazioni industriali. Nelle piante, esteri di cera si trovano principalmente nelle cuticole rivestimento superfici sparare primaria, ma si accumulano anche ad elevate concentrazioni di oli di semi di alcune specie vegetali, tra cui jojoba (Simmondsia chinensis), un arbusto nel deserto che è la principale fonte commerciale di questi composti. Riportiamo l'identificazione e la caratterizzazione di WSD1, un membro della cera bifunzionale estere sintasi/diacilglicerolo aciltransferasi gene famiglia, che svolge un ruolo chiave nella sintesi dell'estere cera in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) gambi, come prima evidenziato da livelli estere cera gravemente ridotta nella cera dei mutanti wsd1 staminali. Saggi in vitro utilizzando estratti di proteina da Escherichia coli che esprimono WSD1 ha mostrato che questo enzima ha un alto livello di cera sintasi attività e circa 10 volte più basso livello di diacilglicerolo aciltransferasi attività. Espressione del gene WSD1 in Saccharomyces cerevisiae ha provocato l'accumulo di esteri di cera, ma non triacilglicerolo, indicando che WSD1 funziona prevalentemente come una cera sintasi. Analisi dell'espressione di WSD1 ha rivelato che questo gene è trascritto in fiori, parti superiore dei gambi e foglie. Completamente funzionale proteina fluorescente gialla proteina-Tag WSD1 era localizzata al reticolo endoplasmatico, dimostrando che biosintesi di esteri di cera, i prodotti finali del percorso di formazione di alcool, si verifica in questo compartimento subcellulare.
Un Metodo Di Fase Solida Per L'estrazione E La Misurazione Dell'anandamide Da Più Biomatrices Umana
N-Arachidonoylethanolamine (AEA, anandamide) fu il primo endocannabinoide per essere identificato e da allora è diventato associato con la mediazione di diverse funzioni fisiologiche e Stati di malattia. AEA è stato isolato da numerosi tessuti e ha, nella gamma bassa nanomolari, utilizzando tecniche di estrazione dei lipidi con solventi organici. Queste tecniche richiedono l'essiccazione giù di volumi relativamente grandi di solventi, che li rende inadatti per l'analisi di alto-rendimento. Qui descriviamo un metodo di estrazione di fase solida (SPE) per l'indagine delle concentrazioni di AEA nel plasma umano, siero, latte, urina, liquido amniotico, liquido peritoneale, saliva, liquido follicolare e fluido da una cisti ovarica. AEA è stato rilevato nel siero e nel plasma dal sangue isolato da 20 donne adulte (significa + deviazioni standard: 0.68+/-0.29 e 0.64+/-0.28 nM, rispettivamente), da donne in gravidanza a termine (1,37 + 0,42 nM) e dalla vena ombelicale (1,26 + 0,33 nM) e arteria ombelicale (1.14 + /-0, .35nM), nel latte (0,12 + /-0,05 nM) e dal liquido amniotico (0,03 + /-0,02 nM), peritoneale (0.93 + 0,27 nM), follicolare (1,17 + 0,51 nM)e cisti ovarica (0,32 + /-0,01 nM) fluidi. AEA era rilevabile nella saliva e nelle urine. L'efficienza di estrazione dell'AEA 60% raggiunto con SPE da plasma era superiore per il 19% di efficienza ottenuto utilizzando il metodo di estrazione con solvente organico esistente. Limiti di quantificazione e di rilevamento per AEA inoltre sono stati migliorati drasticamente usando SPE (8 e 4 fmol/ml) confrontato con estrazione organica (25 e 18,75 fmol/ml di plasma). Questi miglioramenti consentono l'utilizzo di piccoli campioni di plasma con SPE. Intra - e variabilità interday erano paragonabili e la concentrazione media di AEA di campioni di plasma pool (1,18 nM, n = 15) era identico con le due tecniche. Analogamente, quando 56 campioni di plasma da donne lavoratrici e nonlaboring sono stati analizzati utilizzando entrambe le tecniche, sono state osservate differenze non dipendente dal metodo di estrazione. Di conseguenza, forniamo prove per una tecnica robusta SPE per l'estrazione dell'AEA da biomatrices per sostituire i metodi di estrazione liquido esistente, con la tecnica SPE essendo superiore in termini di velocità, l'efficienza di estrazione e dimensione del campione necessaria.
Livelli Di Anandamide Nell'umani Tessuti Riproduttivi Femminili: Estrazione in Fase Solida E La Misura Di Spettrometria Di Massa Tandem in Cromatografia Liquida Di Ultraperformance
Anandamide (N-Arachidonoilethanolamide), una lipide bioattive, è riferito a giocare un ruolo nel mantenimento della gravidanza e del parto. I nostri obiettivi sono stati (1) valutare i livelli di AEA al materno umano: interfaccia fetale e (2) convalidare l'uso dell'estrazione di fase solida dell'AEA dai tessuti. AEA è stato analizzato nel midollo e sangue materno, liquido amniotico, placenta e membrane fetali raccolti durante il taglio cesareo (n = 14). Efficienza di estrazione era 42 e 36% per la placenta e le membrane fetali, rispettivamente. Tessuto AEA è stato quantificato utilizzando un metodo di diluizione isotopica e UPLC-ESI-MS/MS dando la variabilità intra - e inter - giorno per tessuti a spillo con 0,2 e 1 5pmol/g AEA inferiore al 12%. Precisione per questi campioni a spillo era tra 95 e 103% per le membrane fetali e tra 99 e 114% per la placenta. Significa AEA concentrazioni erano 2,72 + o - 1,04 pmol/g per la placenta e 1,19 + o - 0,68 pmol/g per le membrane fetali e 0.93 + o - 0,28, 0.88 + o - 0.33, 0,77 + o - 0,30 e 0,06 + o - 0.04nM per la vena ombelicale, materna e arteria ombelicale plasma e liquido amniotico. Concentrazioni più elevate di AEA sono state trovate nella placenta rispetto alle membrane fetali (P < 0,0001), nella vena ombelicale confrontata con arteria ombelicale (P = 0,0015) e nel plasma dalla circolazione materna confrontato con arteria ombelicale (P = 0.0152). La rilevanza di questi cambiamenti nelle concentrazioni di AEA presso la materna: interfaccia fetale richiede ulteriori indagini.
Gli Endocannabinoidi E Gravidanza
Acylethanolamides come anandamide (AEA) e monoacylglycerols come 2-arachidonoylglycerol sono gli endocannabinoidi che si legano ai recettori dei cannabinoidi, vanilloidi e peroxisome proliferator-activated. Questi composti, loro recettori diversi, la presunta membrana transporter(s) e relativi enzimi che sintetizzano e degradano li sono collettivamente come il "sistema di endocannabinoid (ECS)". Mal definiti meccanismi cellulari e molecolari controllano le azioni biologiche della ECS. Sopra l'ultima prova decennio ha stato emergenti per suggerire che l'ECS gioca un ruolo significativo in vari aspetti della riproduzione umana. In questa recensione, riassumiamo la nostra attuale comprensione di questo ruolo soprattutto il coinvolgimento di AEA ed elementi correlati ECS nella regolazione della reazione acrosomiale, capacitazione e ovogenesi, ovidotto trasporto dell'embrione, l'impianto di blastocisti, sviluppo placenta ed esiti di gravidanza e sopravvivenza degli spermatozoi, motilità. Inoltre, sarà discussa la possibilità che plasma e tessuto AEA e altri cannabinoidi possono rappresentare marcatori diagnostici affidabili dei risultati di riproduzione e gravidanza naturali e assistiti in donne.
Misura Simultanea Di Tre N-acylethanolamides in Bio-matrici Umane Mediante Spettrometria Di Massa Tandem Cromatografia Liquida Ultra Performance
Gli endocannabinoidi compresi N-acylethanolamides (NAEs) sono una famiglia di molecole di segnalazione lipido-correlati implicati in molti fisiologici e Stati di malattia che suscitano le loro attività attraverso i recettori dei cannabinoidi. Anandamide (N-arachidonoylethanolamine, AEA) è il più caratterizzato degli endocannabinoidi ed è stato rilevato in molti tessuti e bio-fluidi tra cui plasma umano e il sistema nervoso centrale. L'endocannabinoide-come NAEs, oleoylethanolamide (OEA) e palmitoylethanolamide (PEA) sono descritti come entourage composti perché illeciti simili effetti fisiologici a AEA ma hanno poca o nessuna affinità per i recettori dei cannabinoidi. Come composti di entourage, livelli di questi NAEs possono influenzare notevolmente l'efficacia dell'AEA ancora ci sono pochi studi che misurano questi composti in bio-fluidi. Qui descriviamo un metodo rapido, altamente sensibile, specifico e altamente riproducibile prestazioni ultra-elevate liquido cromatografia-spettrometria di massa tandem (UPLC-MS/MS) per l'analisi dell'AEA, OEA e pisello in bio-fluidi umani compresi, plasma, siero, latte materno e amniotico. Questo metodo convalidato utilizzando deuterated (standard interno AEA-d(8), OEA-d(2) e PEA-d(4)), rappresenta un miglioramento rispetto alle analisi precedenti in termini di fase (4 min), limite di rilevazione (0,9 fmol sulla colonna per AEA e piselli) e 4,4 fmol sulla colonna per OEA, precisione di esecuzione (deviazioni standard relative delle zone di picco: 3,1% (AEA), 2,9% (OEA) e 5.4% (PEA) per 133 fmol sulla colonna) e precisione (95.1-104,9%). La sensibilità e la precisione del metodo convalidato descritto qui suggerisce che questo metodo è adatto per l'analisi dell'AEA, OEA e pisello in campioni clinici e può essere utilizzato per l'indagine di bio-matrici contenenti una quantità limitata di NAEs.
Associazioni Tra Polimorfismi Funzionali Nei Geni Di Difesa Antiossidante E Urinario Ossidativa Stress Biomarkers in Donne in Premenopausa, Sane
Polimorfismi funzionali nei geni di difesa antiossidante endogeno manganese superossido dismutasi (MnSOD), la catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GPX-1) sono stati collegati con il rischio di cancro in più siti. Anche se si presume che queste varianti di germline impatto rischio malattia alterando la capacità dell'ospite di disintossicare le specie ossigenate reattive mutageno, molto pochi studi hanno esaminato direttamente questa ipotesi. Concentrazioni di 8-isoprostane F2α (8-iso-PGF2α) e 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxoxdG)-sensibili indicatori di perossidazione lipidica e l'ossidazione del DNA, rispettivamente-sono state misurate in campioni di urine 24 h ottenuti da 93 sano, le donne in premenopausa che partecipano a un intervento dietetico prova. Inoltre, il DNA è stato Estratto da sangue per la tipizzazione di MnSOD Val16Ala, CAT-262 C > T e Pro198Leu GPX1 genotipi mediante Taqman saggio. Sebbene concentrazioni media geometrica del 8-iso-PGF2(α) e 8-oxoxdG vario attraverso diverse caratteristiche di studio tra cui corsa, livello di istruzione, indice di massa corporea e i livelli sierici di antiossidante, c'era poca evidenza che questi biomarcatori differivano attraverso uno qualsiasi dei genotipi esaminati. In sintesi, non sembrano essere fortemente associato con i livelli di stress ossidativo sistemico in donne giovani, sani polimorfismi funzionali nei geni di difesa antiossidante endogeno.
