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Articles by Pei Yun Lee in JoVE
JoVE General
Electroforesis en gel de agarosa para la separación de los fragmentos de ADN
Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California Los Angeles
Un protocolo básico para la separación de fragmentos de ADN usando electroforesis en gel de agarosa se describe.
Other articles by Pei Yun Lee on PubMed
Una Red De Regulación Genómica Para El Desarrollo
Desarrollo plan del cuerpo es controlado por las grandes redes de genes reguladores. Una red de gene regulador que controla la especificación del endodermo y mesodermo en el embrión de erizo de mar se resume aquí. La red se deriva del análisis de perturbación a gran escala, en combinación con métodos computacionales, datos genómicos, análisis cis-reguladores y Embriología molecular. La red contiene más de 40 genes en la actualidad, y cada nodo puede ser verificado directamente en el nivel de la secuencia de ADN por análisis cis-regulación. Su arquitectura revela aspectos específicos y generales de desarrollo, tales como células generan sus destinos ordenados en el embrión y por ello el proceso avanza inexorablemente hacia adelante en el tiempo de desarrollo.
Una Red Provisional Gene Regulador Para La Especificación De Endomesoderm En El Embrión De Erizo De Mar
Presentamos la forma actual de una red de gene de regulación basadas en la secuencia de ADN provisional que explica en el esquema de cómo se controla la especificación de endomesodermal en el embrión de erizo de mar. El modelo de la red está en un proceso continuo de revisión y crecimiento como se agregan nuevos genes y disponga de nuevos resultados experimentales; Ver http://www.its.caltech.edu/~mirsky/endomeso.htm (actualización de red End-mes Gene) para la versión más reciente. La red contiene más de 40 genes en la actualidad, muchos recién descubierto en el curso de este trabajo y factores reguladores transcripcionales de codificación más ADN. La arquitectura de la red fue abordada inicialmente por la construcción de un modelo de lógica que integran la amplia evidencia experimental ya está disponible en la especificación de endomesoderm. Los vínculos internos entre genes en la red han sido determinados funcionalmente, medición de los efectos de perturbaciones reglamentarios en la expresión de los genes relevantes en la red. Se han aplicado cinco clases de perturbación: (1) el uso de oligonucleótidos antisentido Morfolino dirigido a muchos de los genes reguladores claves en la red; (2) transformación de otros factores reguladores en dominantes represores por construcción de fusiones de dominio angrelado represor; (3) expresión ectópica de dado factores reguladores, de construcciones de la expresión génica y de mRNAs inyectado; (4) el bloqueo de la vía de la beta-catenina/Tcf por introducción de mRNA codificación del dominio intracelular de cadherin; y la vía de señalización de bloqueo (5) de la ranura de introducción del mRNA codificación el dominio extracelular del receptor Notch. El modelo predice las entradas reglamentarias cis que unen cada gen en la red. Por lo tanto, su arquitectura es comprobable por análisis cis-regulación. Strongylocentrotus purpuratus y Lytechinus variegatus recombinantes de BAC genómicas que incluyen un gran número de los genes en la red han sido secuenciados y anotado. Pruebas de las cis-reguladoras predicciones del modelo se facilitan enormemente por comparación de la secuencia computacional interespecífica, que permite una rápida identificación de elementos cis-reguladores probables antes de análisis experimental. La red especifica procesos regulatorios genómicamente codificados entre escote principio y etapas de la gástrula. Estos controlan la especificación del linaje micromere y el dominio de endomesodermal de veg(2) inicial; la separación de la blástula-etapa del dominio mesodérmico veg(2) central (es decir, el campo de la progenitora mesénquima secundario) del dominio endodermal veg(2) periférica; la estabilización del estado de especificación dentro de estos dominios; y la activación de algunos genes de diferenciación aguas abajo. Cada una de las fases temporales-espaciales de especificación está representada en un subelemento del modelo de la red, que trata de eventos reglamentarios dentro de los núcleos embrionarios pertinentes en etapas.
Marcadores De Expresión Génica Caenorhabditis Elegans Células Vulvares
El análisis de patrones de destino celular durante el desarrollo vulvar de Caenorhabditis elegans ha dependido principalmente de la observación directa de las divisiones de célula y movimientos celulares (análisis de linaje de la célula). Sin embargo, la reconstrucción de la vulva en desarrollo de secciones seriadas EM ha sugerido siete diferentes tipos de células (vulA, vulB1, vulB2, vulC, vulD, Vuleos y vulF), muchos de los cuales no se pueden distinguir en base a estas observaciones. Aquí divulgamos la expresión vulvar de siete genes, egl-17, cdh-3, 2-ceh, zmp-1, B0034.1, T04B2.6 y F47B8.6 basan en fusiones de reportero gfp, cfp y yfp (verde fluorescente proteínas y color variantes). Cada gen se expresa en un subconjunto específico de células vulvares y por lo tanto es útil como un marcador para los sinos vulvar de la célula. Juntos, expresiones de marcadores distinguen seis tipos de células y revelan un estricto control temporal de la expresión génica en la vulva en desarrollo.
Marcadores De Expresión Génica Caenorhabditis Elegans Células Vulvares
El análisis de patrones de destino celular durante el desarrollo vulvar de Caenorhabditis elegans ha dependido principalmente de la observación directa de las divisiones de célula y movimientos celulares (análisis de linaje de la célula). Sin embargo, la reconstrucción de la vulva en desarrollo de secciones seriadas EM ha sugerido siete diferentes tipos de células (vulA, vulB1, vulB2, vulC, vulD, Vuleos y vulF), muchos de los cuales no se pueden distinguir en base a estas observaciones. Aquí divulgamos la expresión vulvar de siete genes, egl-17, cdh-3, 2-ceh, zmp-1, B0034.1, T04B2.6 y F47B8.6 basan en fusiones de reportero gfp, cfp y yfp (verde fluorescente proteínas y color variantes). Cada gen se expresa en un subconjunto específico de células vulvares y por lo tanto es útil como un marcador para los sinos vulvar de la célula. Juntos, expresiones de marcadores distinguen seis tipos de células y revelan un estricto control temporal de la expresión génica en la vulva en desarrollo.
Expresión De Spgatae, El Strongylocentrotus Purpuratus Ortólogo De Vertebrados GATA4/5/6 Factores
Spgatae es el ortólogo de erizo de mar de los vertebrados genes gata4/5/6, según lo confirmado por análisis filogenético. La acumulación de transcritos de Spgatae durante el desarrollo embrionario y el patrón espacial de expresión se divulgan aquí. Expresión se detectó primero en la blástula h 15. El número de moléculas de ARN Spgatae aumenta constantemente durante las etapas de la blástula, con un pico de expresión durante la gastrulación. Después de gastrulación es completa, el nivel de expresión disminuye hasta el final de la embriogénesis. Todo Monte hibridación in situ demostraron que las transcripciones de Spgatae primero fueron detectadas en un anillo de células del mesodermo prospectivo en la placa de vegetal. Spgatae expresión entonces se expande para incluir toda la placa vegetal en la etapa de blástula del mesénquima. Durante la gastrulación Spgatae se expresa en el blastoporo y en etapa de prisma fuertemente en el intestino grueso y del midgut pero no del foregut y también en las células del mesodermo en la punta de la archenteron. Hacia el final de la embriogénesis, disminuye la expresión en el intestino grueso. El terminal patrón de expresión es en el intestino medio más bolsas celómicas.
Strongylocentrotus Purpuratus Factor De Transcripción GATA-E Se Une a Y Reprime La Transcripción En Un Elemento Cis-regulador De Otx-Goosecoid Dentro El Reforzador Aboral Ectodermo Específicos Spec2a
Durante la embriogénesis de Strongylocentrotus purpuratus, aboral expresión de ectodermo-específica de spec2a se basa en un potenciador ascendente que confiere su especificidad espacial en gran parte a través de la represión. El propósito de este estudio fue determinar cómo se reprime la expresión de spec2a en endodermo y ectodermo oral territorios. Un par de 78-bajo la secuencia de la DNA en el reforzador contiene cinco elementos cis-reguladores estrechamente espaciados como proximal (TAATCT) y distales elementos (TAATCC) que se unen a ambos SpOtx, un activador transcripcional ampliamente distribuido y SpGoosecoid (SpGsc), un represor transcripcional restringida ectodermo oral. Aquí mostramos que estos dos elementos aparentemente redundantes de Otx/Gsc tienen distintas funciones. El próximo elemento enlazado a SpGATA-E, un factor de transcripción endomesoderm específicas. Tratamiento con SpGATA-E y SpGsc Morfolino oligonucleótidos antisentidos (MASOs) dio lugar a mayor actividad transcripcional del elemento proximal, sugiriendo que ambos factores funcionaron como represores en este sitio. SpGATA-E tratados MASO embriones no expresan marcadores de ectodermo, indicando un papel para SpGATA-E en la diferenciación del ectodermo. El elemento proximal de spec2a fue distinto al elemento correspondiente en el reforzador spec1 relacionados, y permutas entre elementos cis-reguladores spec1 y spec2a indica, que para represión óptima, el elemento proximal debía interactuar con un elemento de factor de unión a CCAAT cercano. Nuestros resultados muestran que el elemento proximal recientemente evolucionado contribuye a la represión de spec2a en los territorios de ectodermo endomesoderm y oral.
El Genoma Del Erizo De Mar Strongylocentrotus Purpuratus
Divulgamos la secuencia y el análisis del genoma 814-megabase del erizo de mar Strongylocentrotus purpuratus, un modelo de desarrollo y Biología de sistemas. La estrategia de secuenciación había combinado escopeta todo el genoma y secuencias del cromosoma artificial bacteriano (BAC). Este uso de clones BAC, ayudado por una estrategia de agrupación superó dificultades asociadas con el alto heterocigoto del genoma. El genoma codifica unos 23.300 genes, incluyendo muchos pensaba ser vertebradas innovaciones o conocida sólo fuera los deuterostomes. Este genoma de equinodermos proporciona un evolutivo de grupos para las penetraciones de cordados y rendimientos en la evolución de deuterostomes.
Control CIS-regulador Del Gen Nodal, Iniciador De La Red De Gene De Ectodermo Oral De Erizo De Mar
Expresión del gen nodal inicia la red de gene regulador que establece la especificación transcripcional del ectodermo oral en el embrión de erizo de mar. Este gen codifica un ligando de TGFbeta, y en Strongylocentrotus purpuratus su transcripción se activa en el presunto ectodermo oral en sobre la etapa de 30 células. Después de eso Nodal señalización ocurre entre todas las células del territorio ectodermo oral y expresión nodal es necesaria para la expresión de genes reguladores de ectodermo oral. El sistema regulatorio-cis del gen nodal transmite anisótropa distribuidos citoplásmicos señales que distinguen a los futuros dominios orales y aboral del embrión temprano. Aquí establecemos la base genómica para la iniciación y mantenimiento de expresión génica nodal en el ectodermo oral. Módulos de control de cis-regulador funcional del gen nodal fueron identificados por conservación de secuencia interespecífica. Un 5' cis-regulatorios funciones del módulo para iniciar la expresión del gen nodal y mantener su expresión por medio de la entrada de la retroalimentación del sistema de transducción de señal Nodal. Estas funciones están mediadas respectivamente por sitios de destino para factores de transcripción bZIP y sitios de destino SMAD. Al menos un sitio SMAD también es necesario para la iniciación de la expresión. Un módulo del intrón también contiene sitios SMAD que responden a la regeneración Nodal y además actúa para reprimir la expresión vegetal. Estas observaciones explican las principales características de expresión nodal en el ectodermo oral: ya que la actividad de factores bZIP redox sensible y la polarización inicial de oral vs destino aboral se manifiesta en un diferencial de redox, los sitios bZIP son responsables de la activación de nodal del lado oral; y puesto que el inmediato factores de respuesta de transducción de la señal temprana para Nodal son factores SMAD, los sitios SMAD cuenta para el mantenimiento de la retroalimentación de la expresión génica nodal.
Funciones Exclusivas De Desarrollo De Módulos Cis-regulador Gatae En El Embrión De Purpuratus Strongylocentrorus
El gen gatae de Strongylocentrotus purpuratus es orthologous genes de gata-4,5,6 vertebrados. Este gen es expresada en el endomesoderm en la blástula y más adelante el intestino del embrión y se requiere para el desarrollo normal. Un gatae BAC que contiene un reportero GFP en exón uno del gen fue capaz de reproducir todos los aspectos de la expresión gatae endógeno en el embrión. Para identificar la supuesta gatae módulos cis-regulador se llevó a cabo un análisis de la conservación de secuencia interespecífica con respecto a un Lytechinus variegatus gatae BAC, que reveló 25 conserva parches de secuencia no codificante. Éstos fueron probados individualmente en experimentos de transferencia de genes, y se identificaron dos módulos capaces de conducir expresión localizada de reportero en el embrión. Módulo 10 produce temprana expresión en las células del mesodermo y endodermo hasta la etapa de gástrula temprana, mientras que el módulo 24 genera final expresión endodérmico en fases de gástrula y pluteus. Módulo 10 entonces fue eliminada de la gatae BAC por recombinación recíproca, dando por resultado la pérdida total de expresión de reportero en el marco de tiempo en el cual es normalmente activo. Supresión similar de módulo 24 conducido a la expresión de GFP omnipresente en la gástrula y pluteus. Estos resultados muestran que el módulo 10 es únicamente necesaria y suficiente para tomar en cuenta la fase temprana de expresión gatae durante la especificación endomesoderm. Además, implican una exclusión de módulo de cis-regulador funcional, por el que sólo un módulo se puede asociar con el promotor basal y la expresión génica de unidad en un momento dado.
Efecto De La Adición De Carbono Adicional En El Tratamiento De Las Aguas Baja C/N Alta Tecnología Residuales Por MBR
Se investigó el efecto de la adición de carbono suplementario para el tratamiento de aguas residuales industriales de alta tecnología en un biorreactor de la membrana (MBR). El MBR funcionaron para 302days bajo diferentes C/N (relaciones BOD(L)/NH(4)(+)-N), es decir, 0.9-1 a 20 días, 1.6-21 a 42days, 2.9-43 82days, 3.6-83 a 141days, 4.8-165 a 233days y 9.3-240 a 302days. Independientemente de los valores de C/N investigados, eficiencia de remoción de SS y BOD(5) fueron superiores al 95% y superiores al 80% la eficiencia de remoción de bacalao se observó. Además, se observó la nitrificación completa a lo largo de la investigación. Sin embargo, investigó la desnitrificación y la eficiencia de eliminación de nitrógeno total alcanzado sus valores máximos en la más alta relación C/N (9.3). Análisis PCR en tiempo real revelaron 10 veces más amoníaco oxidante las bacterias a la proporción de bacterias totales bajo la más alta condición de relación C/N (9,3) en comparación con la condición de relación C/N baja (1.6).
