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Articles by Peter Poot in JoVE
JoVE General
Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)
1Department of Biochemistry / Analytics, caprotec bioanalytics GmbH, 2Institute of Organic Chemistry, RWTH Aachen University
Capture Compounds sind trifunktionelle kleinen Molekülen, um die Komplexität des Proteoms durch funktionelle reversible kleines Molekül-Protein-Wechselwirkung durch Photo-Vernetzung und Reinigung gefolgt reduzieren. Hier verwenden wir ein Capture Compound mit
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Synthese Von S-Adenosyl-L-Homocystein Erfassen Verbindungen Für Die Selektive Photoinduzierten Isolierung Methyltransferasen
Verstehen das Zusammenspiel der verschiedenen zelluläre Proteine und ihre Substrate ist von besonderem Interesse in der postgenomic-Ära. Zu diesem Zweck selektive Isolierung und Identifizierung von Proteinen aus komplexen biologischen Proben ist notwendig und gezielte Isolation der Enzym-Familien ist eine anspruchsvolle Aufgabe. In den letzten Jahren Methoden wie Activity based Protein Profilerstellung (ABPP) und Erfassung zusammengesetzte Massenspektrometrie (CCMS) wurden entwickelt, um die Reduzierung der Komplexität der Proteome mittels Proteinfunktion im Gegensatz zu standard-Ansätzen, die Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften für Protein Trennung zu nutzen. Isoliert und identifiziert die Subproteome bestehend aus S-Adenosyl-L-Methionin (SAM oder AdoMet)-abhängige Methyltransferasen (Methylome), haben wir entwickelt und synthetisiert trifunktionalen Erfassung Verbindungen, die chemisch stabil Cofaktor Produkt S-Adenosyl-L-Homocystein (SAH oder AdoHcy) als Funktion der Selektivität. SAH-Analoga mit amino Verknüpfungsprogramme auf die N6 oder C8 Positionen wurden synthetisiert und an Gerüsten mit verschiedenen Photocrosslinking Gruppen für kovalente Protein Änderung und Biotin für die Affinität Isolierung. Das Dienstprogramm dieser SAH Erfassung Verbindungen für selektive photoinduzierten Proteinisolierung wird für verschiedene Methyltransferasen (MTases) handeln auf DNA, RNA und Proteine sowie mit Escherichia coli Zelle lysate demonstriert. Darüber hinaus können sie verwendet werden, Dissoziation-Konstanten für MTasen-Cofaktor-komplexe zu bestimmen.
Profilerstellung Methyltransferasen Und Andere S-Adenosyl-L-Homocystein-verbindliche Proteine Durch Massenspektrometrie Compound Erfassen
Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen zur Reduzierung der Komplexität der Proteome auf der Grundlage von funktionalen kleinen Molekül-Protein-Interaktionen. Wir beschreiben einen generischen Ansatz basierend auf trifunktionalen erfassen Verbindungen, in denen das anfängliche Gleichgewicht verschoben Zusammenspiel ein kleines Molekül-Sonde und Ziel-Proteine auf Foto-Vernetzung zwischen eine unabhängige Foto-activable Reaktivität-Funktion des Capture-Compound und die Oberfläche des Ziel-Proteine irreversibel fixiert ist. Anschließend werden Capture Compound - Protein Konjugate isoliert von den komplizierten biologischen Mischungen über die Sortierfunktion der Capture-Compound. Hier beschreiben wir die Anwendung von einem trifunktionalen erfassen, Verbindung, die der Methyltransferase Produkt Hemmer S-Adenosyl-L - Homocystein als die Selektivität-Funktion für die Isolierung von Methyltransferasen aus einem Komplex von Escherichia coli DH5α Zellen lysate führt. Foto aktivierte Vernetzung steigert Ertrag und Empfindlichkeit des Experiments und die Spezifität kann leicht für im Wettbewerb-Experimente, die mit einen Überschuss an freien S-Adenosyl-L - Homocystein getestet werden.
