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Articles by Reeder Robinson in JoVE
JoVE Bioengineering
El seguimiento de los reductores y oxidativo semirreacciones de una flavina monooxigenasa dependiente del uso de espectrofotometría de flujo detenido
Department of Biochemistry, Virginia Polytechnic Institute and State University
Se describe la utilización de un instrumento de flujo detenido para investigar tanto los reductores y oxidativa semirreacciones de
Other articles by Reeder Robinson on PubMed
La Unión Del Sustrato Modula La Actividad De Mycobacterium Smegmatis G, Una Flavina Monooxigenasa Dependiente De Implicados En La Biosíntesis De Hidroxamato Contienen Sideróforos
Mycobacterium smegmatis G (MbsG) es una monooxigenasa flavina-dependiente que cataliza la NAD (P) H y oxígeno dependiente-hidroxilación del grupo amino terminal en la cadena lateral de L-lisina en la ruta biosintética de la micobactina sideróforo. Mycobactins son esenciales para el crecimiento micobacteria bajo de hierro limitativos condiciones encontradas durante la infección en los mamíferos. Así, las enzimas implicadas en la biosíntesis de micobactina representan posibles objetivos farmacológicos. MbsG se expresó en E. coli y se purificó mediante afinidad de metal y cromatografías de intercambio iónico. Recombinante MbsG representa el primer miembro de esta clase de enzimas aisladas en la forma activa, con un cofactor FAD fuertemente unido. La k (cat) valor para la formación de hidroxilado l-lisina bajo condiciones de estado estacionario fue de 5,0 min (-1), y K (m) valores de 0,21 mM de L-lisina, 1,1 mM de NADH y NADPH 2,4 mM para Se calcularon. La enzima funciona como una oxidasa cuando la actividad de MbsG se midió por el consumo de monitorización de oxígeno en la ausencia de L-lisina, oxidando el NADH y NADPH con K (cat) valores de 59 y 49 min (-1), respectivamente. Bajo estas condiciones, MbsG producido tanto peróxido de hidrógeno y superóxido. En contraste, cuando l-lisina estaba presente, la reacción se hizo más acoplado, produciendo hidroxilado l-lisina y la disminución de la actividad de oxidasa. Estos resultados sugieren que la unión sustrato modula la función de MbsG de una oxidasa a una monooxigenasa.
Un Ensayo De Fluorescencia Polarizada Vinculante Para Identificar Inhibidores De Flavin Dependientes De Monooxigenasas
N-hidroxilación monooxigenasas (ONM) son esenciales para la patogénesis de los hongos y micobacterias. NMO catalizar la hidroxilación de la lisina y la ornitina en la biosíntesis de hidroxamato contienen sideróforos. La inhibición de la monooxigenasa quinurenina (KMO), que cataliza la conversión de L-3-quinurenina de hydroxykynurenine, alivia los trastornos neurodegenerativos como la de Huntington y las enfermedades de Alzheimer y las infecciones cerebrales causadas por el parásito Trypanosoma brucei. Estas enzimas son ejemplos de la flavina-dependientes monooxigenasas, que se validan los objetivos de la droga. A continuación, describimos el desarrollo y optimización de un ensayo de polarización de la fluorescencia para identificar inhibidores potenciales de monooxigenasas Flavin. Marcadas con fluorescencia moléculas de ADP fueron sintetizados y ensayados. Un cromóforo ADP-TAMRA obligado a KMO con una K (d) el valor de 0,60 ± 0,05 mM y el NMOS de Aspergillus fumigatus y Mycobacterium smegmatis con K (D) los valores de 2,1 ± 0,2 micras y 4,0 ± 0,2 micras, respectivamente. El ensayo fue probado en experimentos de inhibición con sustratos y productos de KMO y un NMO. Además, se demostró que este ensayo puede ser utilizado para identificar inhibidores de NMOS. Un Z 'factor de 0,77 se calculó y se demuestra que el ensayo presenta una buena tolerancia a la temperatura, tiempo de incubación, y la concentración de DMSO.
