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Articles by Sandra Rieger in JoVE
JoVE General
双光子现场斑马鱼的胚胎干切断和时间推移共焦成像
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 2Departments of Neurology and Neurobiology, University of California, Los Angeles
在这里，我们描述了一个用于安装长期成像，双光子成像和组织损伤的技术，和时间推移共焦成像的斑马鱼胚胎的方法。
Other articles by Sandra Rieger on PubMed
识别和验证的小说 ERBB2 纽 HER2） 包括基因参与血管生成的目标。
V-雇员再培训局-b2 造血白血病病毒癌基因同源 2 （ERBB2 ； 同义词 HER2，纽） 对跨膜糖蛋白酪氨酸激酶特定的活动，作为不同的信号转导过程中的主要交换机与进行编码。在大量的人类癌症，包括乳腺癌、 卵巢及肾脏癌发现 ERBB2 扩增和表达。我们的目标是探测 ERBB2 调节靶基因的全基因组规模及其致瘤性的影响作出贡献。ERBB2 转染和野生型小鼠成纤维细胞的基因差异表达谱监测采用 DNA 芯片。所选基因的表达调控经 RT-PCR 检测核实，并由印迹分析验证。基因组广泛的基因表达谱确定 (i) 已知目标的 ERBB2 信号、 (ii) 基因与肿瘤的关系受牵连，但迄今未与 ERBB2 信号以及 (iii) 未与恶性转化，包括不带批注功能的新基因关联的基因关联。我们还发现至少一小部分的 coexpressed 基因对基因组与密切相关。ERBB2 过表达抑制转录的反血管增生的因素 （例如，Sparc，Timp3，Serpinf1)，但诱导的血管生成因子 （例如，Klf5，Tnfaip2，Sema3c） 的表达。依赖的 ERBB2 基因调控分析揭示潜在的诊断标志物和假定的治疗靶点的汇编。Colocalize 基因组中的 coexpressed 基因的鉴定可能表明需要进一步研究，以评估功能 coregulation 的基因调控机制。（可以在 http://www.interscience.wiley.com/jpages/0020-7136/suppmat/index.html 国际癌症杂志网站上找到补充材料的这篇文章）。
同时分析 MDR1 C3435T，G2677T/A，与 C1236T 基因型的多路复用 Mutagenically 失散聚合酶链反应。
P-糖蛋白 (PGP) 多药耐药性 1 (MDR1) 基因编码是 ATP 结合盒 （ABC） 农用运输车家庭，所涉及的各类药物的药代动力学与生物利用度的药物转运蛋白的成员。已确定几个 MDR1 基因的单核苷酸多态性 (SNPs) 到目前为止，可能会影响 PGP 表达水平和功能。因此，MDR1 基因多态性和确定具体的单倍型基因分型可能成为预测发展中国家药物抗性遗传易感性的重要工具。我们开发了基于 mutagenically 失散聚合酶链反应 (MS-聚合酶链反应) 的原则的快速和可靠同时基因分型的外显子 MDR1 基因和两个附加 SNPs (G2677T/A 的外显子 21 和 C1236T 在外显子 12) 26 C3435T 多态性与 MDR1 C3435T 连锁不平衡的新多路复用特异性 PCR 方法。准确性和可靠性，这种方法证实了各区域在 MDR1 基因测序。这个新开发的 MDR1 MS PCR 将有助于快速、 准确、 经济 MDR1 基因型分析，并将提供优化个人治疗方法中的重要信息。
量子点是在斑马鱼胚胎中的强大多用途重要贴标代理人。
最近，无机荧光造影剂组成的半导体材料进行了生物成像方法。这些所谓的量子点提供独特的、 有前途的属性到的有机物质的来源，但内活生物体的造影剂其作为已有限，可能由于部分对其体内的容忍的关注。我们使用透明的斑马鱼胚胎，量子点与一系列的活体成像问题面临的挑战。我们表明量子点提供高产荧光内有针对性地组织、 拥有巨大的光稳定性、 可以针对特定的亚细胞车厢、 仍在沿袭示踪剂作为目标单元格内、 轻松分离从常规的有机荧光染料、，都是可修复的允许他们现场录音后与免疫组织化学相结合使用。因此，量子点结合不同有机荧光造影剂的特定优势，有望成为可行的持久延时活体研究的第一次荧光。最后，我们显示的 co-labeling 血管的血管系统和神经系统，建立这些网络，可能在某些身体部位，使用相同的指导线索主要轴突大片，而在其他国家，这两个网络似乎从另一个独立发展。因此，明亮荧光的量子点将有助于解开许多开放性问题在胚胎学、 细胞生物学以及震撼和疾病诊断等领域。
人的因素第二 (凝血酶原） 基因 G20210A 突变分析的参考资料 (RMs)。
科学委员会的分子生物学技术 (C-MBT) 在临床化学后续协调会发起了一个联合项目与欧洲联盟委员会、 联合研究中心、 研究所的参考材料和测量以研制、 生产质粒型参考材料 (RMs) 分析人凝血酶原基因 G20210A 突变的合作。尽管 DNA 测试对临床决策有很大影响，在诊断实验室中执行的测试的数目是高质量和质量保证的问题存在，和目前仅用于临床遗传测试几个 RMs 都可用。基因片段选择制作了跨越所有退火站点发布到日期的底漆。此基因片段野生型及突变型两个等位基因被克隆到 pUC18 质粒和两个质粒制作了 RMs。此外，还制作了两个质粒的混合物来模仿呈杂合子基因型。本研究报告描述了在互换研究中，由 9 个不同的方法，在 13 专家实验室测试的这些参考材料的性能。这一系列的质粒 RMs 将尽我们所知，第一个质粒型临床遗传 RMs 介绍世界各地。
Thr715Pro P-选择素基因多态性与缺血性中风的风险无关。
苏氨酸 > Pro 子 715 P-选择素基因的编码区多态性最近被描述。个人携带的 Pro715 等位基因据报已减少的心肌梗死的风险。这一多态性与缺血性脑卒中的风险可能协会目前正在讨论中。
C 蛋白启动子多态性与脓毒症患儿全身脑膜炎双球菌血症相关联。
脑膜炎球菌病可表现为脓毒症、 脑膜炎或两者的组合。重要调节器的凝血酶活性蛋白 C （PC）。两个多态性的 PC A 1641G C 1654T） 启动子区证明会影响 PC 的级别。脑膜炎球菌脓毒症的病人，在 PC 水平低已日益的严重和糟糕的结果关联起来。我们建立了多中心的病例对照研究，以确定 PC 启动子区多态性是否与发生和脑膜炎球菌病和脓毒症的结果相关联。这项研究列入了 288 以往健康的儿童，从德国、 瑞士、 意大利、 奥地利和 309 健康控件的 97 儿科医院脑膜炎双球菌感染。受养人年龄-强效果被发现。患者 1 年进行显著更经常比健康控件 CG CG 基因型比年轻 (28.6%和 17.8%，P = 0.04）。CG 等位基因的携带者表明 3.43-fold 增加的几率比 (OR) 制定脓毒症 (95 %ci： 1.05-11.20 ； 85.7%对比 63.6%，P = 0.036)。TA-TA 基因型赋予发展的脓毒症的保护作用 (P = 0.017) 与霍尔丹或 0.09 （95 %ci： 0.01-0.94)。收缩期血压值均明显降低患者携带 CG CG 基因型 (86 毫米汞柱，P 与 70 = 0.005)，和需要大大高于肾上腺素能支持 （70%与 26%，P = 0.018)，从而导致或 6.61 （95 %ci： 1.28 34.14)。这些研究结果显示在幼儿中 PC 启动子的基因型是遗传易感性的脑膜炎球菌病、 脑膜炎球菌脓毒症、 降低血压、 和肾上腺素能支持需要的发展。
斑马鱼胚胎的透射电镜的制备。
引言本协议描述了固定和嵌入的斑马鱼胚胎在器官发生阶段 (48-72 小时 post-fertilization [hpf]) 透射电镜 (TEM) 的程序。各个步骤的长度可根据标本的发展阶段进行调整。
人类细小病毒 B19 的血浆和静脉注射免疫球蛋白的中和。
人类细小病毒 B19 （B19V） 是非常流行的病原体，并已表明血浆衍生产品制造的等离子体池包含 B19V 抗体 (B19V 免疫球蛋白 G [IgG]）。
斑马鱼小脑菱形唇是生产颗粒细胞群体的不同功能车厢空间上图案。
菱形上唇突出的胚区的小脑，最近表现，随着时间的推移从空间子域生成不同的神经元细胞类型。我们有特点派生的菱形上唇颗粒细胞人口范围内稳定绿色荧光蛋白转基因斑马鱼的斑马鱼小脑形态发生的分化。其次是个别颗粒细胞跟踪的延时分析演示斑马鱼菱形上唇空间上的图案，沿其多轴同时生产不同颗粒细胞群体。定时录制的平行纤维预测和逆行标记揭示空间阵列内的菱形嘴唇上对应的两个不同功能车厢的成熟的小脑颗粒细胞： 耳三角 granularis 和语料库裂。这些硬骨鱼类的小脑隔对应于哺乳动物 vestibulocerebellar 和非 vestibulocerebellar 系统分别任职的平衡和运动控制。在脊椎动物的小脑发展很高的保育，鉴于空间哺乳动物颗粒细胞人口和其对应的分区较早生产深原子核通过阵列内的菱形嘴唇上可能还划定小脑的独特功能车厢。所以，通过小脑胚区早期大脑发育的时空阵列订了我们的调查结果提供解释如何具体功能小脑线路。
Polysialyltransferase 表达式链接到发展中国家和成年斑马鱼的神经细胞迁移。
细胞粘附的调制是关键调节神经元迁移和维护结构中的胚胎和成熟的大脑的可塑性。这种调制可通过酶唾液酸 （PSA） 附件对神经细胞粘附分子 (NCAM) 通过 STX 和 PST 的 polysialyltransferases。因此，STX 和 PST 的差异表达很可能在神经元分化、 维修、 可塑性，再生期间负责 PSA NCAM 的不同职能。我们已经隔离斑马鱼同系物的 STX (St8sia2) 和 PST （St8sia4），并表明他们在胚胎和成人中枢神经系统中的表达往往限于神经细胞迁移的区域。此外，成人小脑的互补表达模式的两个 polysialyltransferases 建议中调节小脑神经元可塑性的函数。PSA 胚胎小脑结果在受损神经细胞迁移中，暗示 PSA NCAM 关键调节器的动力的小脑神经元祖细胞中的酶法去除。
钙粘蛋白-2 控制定向链小脑颗粒神经元的迁移。
据报在许多脊椎动物中长距离迁移的鉴别与小脑的菱形上唇的颗粒细胞。然而，亚细胞动力学和调节体内定向神经细胞迁移的分子机制的了解才刚刚开始出现。在这里我们显示延时成像对鼠小脑颗粒细胞迁移链状结构中以同型胶质细胞无关的活斑马鱼 (表达序列标签斑马鱼） 胚胎。斑马鱼钙 2 突变的时空救援揭示了直接的作用，为此粘附分子介导链的形成和颗粒细胞连贯洄游行为。此外，钙 2 保持定位的单元格偏振方向的迁移，而钙 2 突变体颗粒细胞的前缘形成的网站和中心体定位随机选择的。因此，粘连的缺乏会导致与 mispositioning 钙粘蛋白-2 缺陷颗粒细胞因此受损方向迁移。此外，这些细胞无法正常成熟颗粒神经细胞分化。钙粘蛋白-2 本地化的活体成像单元格运动期间透露此粘附分子动力学。Intramembraneous 运输由个别洄游步骤开始时钙 2 暂态集中在前面的颗粒细胞。在领先的钙粘蛋白 2 存在对应于观测中心体方向迁移的方向。我们的研究结果表明钙粘蛋白-2 斑马鱼颗粒细胞迁移过程中通过不断协调单元格接触和通过重塑多形核白细胞导致路口细胞极性发挥着关键作用。多形核白细胞含钙导致路口已通过微管纤维与中心体连接，作为我们的研究结果给予领先边缘和中心体定位在 nucleokinetic 的许多脊椎动物神经元人口迁移过程的机制解释。
定时拍摄成像的神经发展： 斑马鱼带头进入第四个维。
延时成像往往是欣赏完全许多动态单元格运动对神经发展至关重要的唯一途径。斑马鱼具备多项优势，使它们的动态发展事件实时成像最好的脊椎动物模型生物体。这一审查将讨论技术考虑延时成像实验在斑马鱼中的描述了所选的例子的显像研究斑马鱼，揭示了新的功能或原则的神经发育，并考虑的承诺和挑战的未来延时研究斑马鱼胚胎和成人神经发育。
过氧化氢促进斑马鱼皮肤损伤致周围神经感觉轴突再生。
从皮肤损伤的功能恢复需要不仅愈合和皮肤细胞的再生，但皮肤的神经再支配的体感外设轴突的结局。调查如何感觉轴突再生和伤口愈合是协调，我们目击体感轴突行为并截肢幼虫斑马鱼的尾鳍。鱼翅截肢大力促进再生的附近的感官神经轴突，可以模仿的烧蚀几个角质形成细胞在正文中任意位置的影响。由于损伤产生活性氧物种过氧化氢 (伤口附近的 H(2)O(2))，我们测试是否 H(2)O(2) 对皮肤轴突再生的影响。斑马鱼幼虫接触亚致死级别的外源 H(2)O(2) 促进角质形成细胞损伤，如果没有切断神经轴突生长和抑制 H(2)O(2) 生产阻止轴突生长促进和影响的鳍截肢角质形成细胞消融。因此，H(2)O(2) 信号帮助协调周边感官轴突神经再支配的皮肤伤口愈合。
皮肤细胞和皮肤感官神经轴突斑马鱼的协调发展。
外围的感官神经轴突支配早在胚胎发生检测触摸刺激表皮。为皮肤神经支配的时间进程和感官神经轴突与皮肤细胞之间的相互作用的性质特点在早期发展阶段，我们进行了详细的分析，在头、 躯干和从 18 到 78 小时 postfertilization 的斑马鱼胚胎和仔尾皮肤神经支配。这一分析结合实时成像表示强调感觉神经元和皮肤细胞，转基因鱼的透射电镜 (TEM) 和串行扫描电镜 （sSEM）。斑马鱼，皮肤上皮的两个图层中，最初由组成和轴突神经支配的第一波都是免费的结局。成熟的上皮细胞不谋而合，但不依赖，其神经支配的外围感官神经轴突。我们发现外周神经轴突最初 arborize 之间的两个上皮皮肤层，但不是内基膜，作为发生的其他生物。引人注目的是，随着发展，神经轴突成为紧紧笼罩内基底角质形成细胞，暗示角质形成细胞可结构或功能的角色，与雪旺氏细胞，在 somatosensation 介导这些感觉神经元的安排。
