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Articles by Tobias Brambrink in JoVE
JoVE General
La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4
Whitehead Institute for Biomedical Research, Massachusetts Institute of Technology
Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.
Other articles by Tobias Brambrink on PubMed
La Pérdida Global De Impresión De Datos Lleva a Tumorigénesis Generalizada En Ratones Adultos
La pérdida de la impronta (LOI), se observa comúnmente en los tumores humanos, se refiere a la pérdida de la regulación génica monoalélica normalmente conferido por los padres de origen específicos de metilación del ADN. Para probar la función de la carta de intención en la tumorigénesis, hemos desarrollado un modelo mediante el uso de desmetilación transitoria para generar impronta libre de células madre embrionarias de ratón (SI-ES células). Fibroblastos embrionarios derivados de células madre embrionarias (SI-SI-MEFs) la resistencia a la pantalla TGFbeta y la expresión de p19 y p53 reducida y forman tumores en los ratones SCID. IF-MEFs muestran la inmortalización espontánea y cooperar con H-Ras en la transformación celular. Animales quiméricos derivados de las células-ES SI desarrollar tumores múltiples que surgen de la inyección de células madre embrionarias-SI dentro de los 12 meses. Estos datos demuestran que LOI solo puede predisponer a las células a la tumorigénesis y identificar una vía a través del cual la inmortalidad conferida por LOI reduce el umbral para la transformación.
Las Células Madre Embrionarias Derivadas De Blastocistos Clonados Y Fertilizados Son Transcriptionally E Indistinguible De Vista Funcional
La clonación reproductiva es rechazada de manera uniforme como una tecnología válida en los seres humanos a causa de los fenotipos anormales que se observan graves en los animales clonados. Aberraciones de expresión de genes observados en los tejidos de animales clonados también han planteado preocupaciones en relación con la aplicación terapéutica de "a medida" madre embrionarias (ES) las células obtenidas por transplante nuclear (NT) a partir de células somáticas de un paciente. Aunque los experimentos anteriores en ratones han demostrado que el potencial de desarrollo de células ES derivadas de blastocistos clonados (NT-ES células) es idéntica a la de las células embrionarias derivadas de blastocistos fertilizados, una caracterización sistemática molecular de líneas celulares de NT-ES es insuficiente. Para investigar si las aberraciones de la transcripción, similares a los observados en los tejidos de los ratones clonados, también se producen en las células madre embrionarias-NT, se han comparado los perfiles de transcripción de ratón NT-10 y la fertilización, derivado de líneas celulares embrionarias. Presentamos aquí que las líneas de células madre embrionarias derivadas de blastocistos clonados de ratón fertilizado y no se distinguen en función de sus perfiles de transcripción, de acuerdo con su potencial de desarrollo normal. Nuestros resultados indican que, en contraste con el desarrollo embrionario y fetal de los clones, el proceso de derivación de células de NT-ES rigurosamente selecciona para esas células inmortales que han borrado la "memoria epigenética" del núcleo del donante y, por tanto, ser funcionalmente equivalentes. Nuestros hallazgos apoyan la idea de que las líneas de células madre embrionarias derivadas de blastocistos clonados o fertilizada tienen un potencial terapéutico idéntico.
Los Complejos Polycomb Reprimir Reguladores Del Desarrollo De Células Madre Embrionarias Murinas
Los mecanismos por los que madre embrionarias (ES) las células auto-renovarse, mientras que el mantenimiento de la capacidad de diferenciarse en prácticamente todos los tipos de células adultas no son bien entendidos. Grupo Polycomb (PCG) las proteínas son represores transcripcionales que ayudan a mantener la identidad celular durante el desarrollo de los metazoos por la modificación epigenética de la estructura de la cromatina. PcG proteínas tienen un papel esencial en el desarrollo embrionario temprano y se han implicado en la celda ES pluripotencia, pero pocos de sus genes diana son conocidos en los mamíferos. Aquí nos muestran que las proteínas PcG directamente a reprimir una gran cohorte de los reguladores del desarrollo en células madre embrionarias de ratón, la expresión de que de otra manera promover la diferenciación. Uso de todo el genoma análisis de la ubicación en células madre embrionarias murinas, se encontró que los complejos Polycomb represivas PRC1 y PRC2 co-ocupados 512 genes, muchos de los que codifican factores de transcripción con papeles importantes en el desarrollo. Todos los genes co-ocupados contenida nucleosomas modificados trimetilada Lys 27 en la histona H3). De acuerdo con un papel causal en el silenciamiento de genes en células madre embrionarias, PCG genes diana se de-reprimida en las células deficientes para el componente de PRC2 Eed, y fueron activadas preferentemente en la inducción de diferenciación. Nuestros resultados indican que la represión dinámica de las vías de desarrollo de complejos Polycomb pueden ser necesarios para el mantenimiento de células ES pluripotencia y la plasticidad durante el desarrollo embrionario.
In Vitro La Reprogramación De Fibroblastos En Un Pluripotentes De Células TE, Como Estado
Trasplante nuclear puede reprogramar el genoma somática de nuevo en un estado epigenético embrionario, y reprogramar el núcleo puede crear un animal clonado o producir células madre embrionarias pluripotentes. Un uso potencial del enfoque de la clonación nuclear es la derivación de 'personalizada' madre embrionarias (ES) las células para el tratamiento celular específica del paciente, pero las consideraciones técnicas y éticas impiden la aplicación terapéutica de esta tecnología. La reprogramación de los fibroblastos a un estado pluripotente puede ser inducida in vitro a través de la expresión ectópica de los cuatro factores de transcripción Oct4 (también llamado Oct3 / 4 o Pou5f1), Sox2, c-Myc y Klf4. Aquí nos muestran que la metilación del ADN, la expresión génica y el estado de la cromatina de tales células inducidas madre reprogramadas son similares a los de las células ES. Notablemente, las células derivadas de ratón-fibroblastos-pueden formar quimeras viables, pueden contribuir a la línea germinal y puede generar vivos tardíos embriones cuando se inyectan en blastocistos tetraploides. Nuestros resultados muestran que la potencia biológica y el estado epigenético de la in-vitro reprogramado las células madre pluripotentes inducidas son indistinguibles de los de células madre embrionarias.
El Tratamiento De Un Modelo De Ratón Anemia De Células Falciformes, Con Células IPS Generadas a Partir Piel Autóloga
Recientemente se ha demostrado que los fibroblastos de ratón y humanas pueden ser reprogramadas en células madre embrionarias un estado como de la introducción de combinaciones de cuatro factores de transcripción. Sin embargo, el potencial terapéutico de tales madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células aún por definirse. Mediante el uso de una célula de la hoz humanizado la anemia modelo de ratón, nos muestran que los ratones pueden ser rescatados después del trasplante de progenitores hematopoyéticos, con obtenidos in vitro de las células iPS autólogas. Esto se logró después de la corrección del alelo falciforme hemoglobina humana por los genes específicos de la orientación. Nuestros resultados proporcionan una prueba de principio para el uso de factor de transcripción inducida por la reprogramación en combinación con terapia génica y celular para el tratamiento de la enfermedad en ratones. Los problemas asociados con el uso de retrovirus y oncogenes para la reprogramación deben ser resueltas antes de que las células iPS pueden ser considerados para la terapia humana.
La Expresión Secuencial De Los Marcadores De Pluripotencia Durante La Reprogramación Directa De Células De Ratón Somáticos
Pluripotencia puede ser inducida en células diferenciadas de murinos y humanos por la transducción retroviral de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc. Hemos diseñado una estrategia de reprogramación en la que estos cuatro factores de transcripción se expresan a partir de doxiciclina (DOX)-inducible lentiviral vectores. El uso de estas construcciones inducible, hemos derivado madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) y descubrieron que el silenciamiento del transgén es un requisito previo para la diferenciación de las células normales. Hemos analizado la temporización de la activación conocido marcador pluripotencia durante derivación ratón célula iPS y observó que la fosfatasa alcalina (AP) se activó primero, seguido por la etapa específica de antígeno embrionario 1 (SSEA1). Expresión de Nanog y el gen endógeno Oct4, marcando células totalmente reprogramadas, sólo se observó tarde en el proceso. Es importante destacar que los cDNAs de manera viral por transducidas necesaria para ser expresado por lo menos durante 12 días con el fin de generar células iPS. Nuestros resultados son un paso hacia la comprensión de algunos de los eventos moleculares que regulan la reprogramación epigenética.
Conexión De Genes De MicroARN Con El Core De Circuitos De Regulación Transcripcional De Las Células Madre Embrionarias
Los microARN (miRNA) son cruciales para el normal madre embrionarias (ES) de células auto-renovación y diferenciación celular, pero ¿cómo la expresión de genes miRNA es controlada por los principales reguladores de la transcripción de células madre embrionarias no se ha establecido. Se describe aquí el circuito de regulación transcripcional de células madre embrionarias, que incorpora la codificación de proteínas y los genes miARN basadas en el chip-ss datos de alta resolución, la identificación sistemática de los promotores de miRNA y la secuencia cuantitativa de las transcripciones de corta duración en múltiples tipos de células. Encontramos que los principales factores de transcripción de células madre embrionarias están asociados con los promotores de miRNAs que se expresa preferentemente en células madre embrionarias y con los promotores de un conjunto de genes miRNA en silencio. Este conjunto de silencio de los genes miARN es co-ocupado por las proteínas del grupo Polycomb en células madre embrionarias y programas de expresión tejido-específica en las células diferenciadas. Estos datos revelan que los principales factores de transcripción de células madre embrionarias promover el programa de células ES miARN expresión y la integración de los miRNAs en los circuitos reguladores que controlan la identidad de la célula ES.
