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Articles by Tuhina Banerjee in JoVE
JoVE Immunology and Infection
表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出
Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida
このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。
Other articles by Tuhina Banerjee on PubMed
2,2,2 トリフルオロエタノール誘起モルテングロビュール状態のコンカナバリンと 8 Anilinonaphthalene のバインディング スルホネート エネルギー論: 熱量と分光学的調査。
コンカナバリン A と 2,2,2 トリフルオロエタノール （TFE） の相互作用は pH 2.5 および 5.2 で示差走査熱量、等温滴定型熱量計 (ITC), 円二色性 (CD) および蛍光分光法の組み合わせを使用して調べた。すべての pH 値の両方で熱量の遷移の可逆的であることが見つかりました。4 Mol kg(-1) 存在下で TFE ph 2.5, コンカナバリン A ネイティブの三次構造の大幅な損失を部分的に折り畳まれた状態になることがわかった。ネイティブ TFE 誘起部分的に折り畳まれた状態からの遷移における特定の側鎖相互作用の損失は、協調の熱転移の損失と芳香族地域における CD バンドの削減によって示されます。アクリルアミド焼入れ、8 anilinonaphthalene スルホン酸 (ANS) バインド、およびエネルギー伝達も 4 mol の存在下ではモルテングロビュール状態における kg(-1) TFE で pH 2.5 コンカナバリン A が示唆されました。ITC が初めて ANS バインディングをモルテングロビュール状態のエネルギー論を特徴付けるために使用されています。ITC 結果 ANS のバインディング モルテングロビュール状態と酸誘起状態で pH 2.5 に不均一結合部位の相互作用のない 2 つのクラスに表示されることを示します。結果ロール疎水および静電相互作用バインディングで ANS のコンカナバリン A への洞察を提供します。また ITC 定性的および定量的蛋白質の部分的に折れた状態を特徴づけるために使用できることが示唆されました。
麻酔の 2,2,2 トリフルオロエタノール ウシ血清アルブミンの直接バインドまたは溶媒媒介効果によってやり取りは？熱量と分光学的調査。
ウシ血清アルブミン (BSA) の熱変性 2,2,2-示差走査熱量高感度したを使用してトリフルオロエタノール存在下 （TFE） を研究されています。熱転移に伴う量的熱力学パラメーターを評価されています。TFE 安定剤または BSA の折り畳まれた状態によって pH の不安定要因たるに観察されます。CD 分光で BSA のアルファ ヘリカル コンテンツの増加と減少増加 molalities TFE の存在下で立体構造を明らかにしました。等温滴定熱量測定結果では、かなりのバインディング TFE 分子に BSA は示されません。TFE を高い molalities のみ BSA の定常トリプトファン蛍光消光し、低い molalities トリプトファン蛍光に及ぼす影響はありません。この仕事で得られた熱量と分光学的結果 TFE と BSA の相互作用の溶媒媒介効果の支配し、結合コンポーネントが非常に弱い可能性があります提案します。結合コンポーネントが非常に弱いので重要だが、不特定の膜蛋白質の機能を影響こと TFE 分子、実際のターゲット上の麻酔作用の可能性のいずれかの脂質二分子膜の構造と動的物性の摂動を通じてかもしれません。
ナプロキセンとアミトリプチリンとウシ血清アルブミンとの結合: 年会側面。
（これは、抗炎症） 薬ナプロキセンと （これは抗うつ剤） アミトリプチリンとウシ血清アルブミン (BSA) のバインディングは、等温滴定型熱量計 (ITC) を使用して蛍光と円二色性分光法との組み合わせで研究されています。ナプロキセンはより強くよりアミトリプチリンに BSA をバインドするには観察されます。温度依存の ITC 結果ナプロキセンの 1 つの分子を 1 つ以上の蛋白質分子の相互作用を示します。その一方で、アミトリプチリンに BSA 1:1.2 から 1:2.8 9 異なります、反応の化学量論とバインドします。BSA にバインド、2 ステートのバインド プロセスの遵守を示すナプロキセン場合熱量エンタルピーとよく結合定数の温度依存性からは計算されます、ヴァントホッフ Hoff エンタルピーに同意します。ただし、その不一致アミトリプチリン場合は温度の上昇と同様、リガンド結合タンパク質の構造変化を示します。分光の結果は、バインディングの結果としてかなりのコンフォメーション変化を示唆しなかった;それ故に、不一致の温度誘起コンホメーション変化に起因する可能性が。イオン強度の増加と結合親和性の BSA にナプロキセンを削減が観察されます。これは錯形成プロセスにおける現行の静電相互作用を示唆しています。バインディングの疎水性相互作用アミトリプチリンのするに BSA の優勢は、任意のイオン強度依存性の欠如によって示されます。静電相互作用ナプロキセン バインディングに BSA の場合の優位性と疎水性相互作用アミトリプチリン バインディングに BSA の場合は、さらにイオン性及び非イオン性界面活性剤存在下で実行したバインディング実験の結果によって強化されます。バインディング パラメーターは、トリトン X 100 BSA に向かってアミトリプチリンの結合親和性をそれによって変更、BSA の疎水結合サイトをブロックすることを示します。これらの薬の結合部位の部分的な重複は、ナプロキセン アミトリプチリン BSA コンプレックスと逆の滴定で得られたバインディング パラメーターによって示されます。したがって、結果ナプロキセンとアミトリプチリンのバインディングの定量的理解 BSA のためと併用療法で治療上のエージェントとして個別にその効果を理解することが重要です提供します。
8 Anilinonaphthalene スルホン酸二量体と 4 量体コンカナバリン A: エネルギー論とその意義等温滴定型熱量計・分光法による糖類バインディング上へのバインド。
コンカナバリン A を検討する 8 anilinonaphthalene スルホン酸のバインディング。等温滴定型熱量計 (ITC) と円二色性の研究は、バインディングを理解する別の実験条件下で実行されて定量的と異なる力それを担当の貢献を評価します。等温滴定熱量測定結果は pH 5.2 と 2.5、ANS とコンカナバリン A のどこな二量体として存在するバインディングの不均質性と外乱無干渉化サイトの 2 つのクラスが示されました。ネイティブ pH 2.5 から結合定数の強化 ANS 結合タンパク質の電荷とコンカナバリン A 近紫外 CD 結果によって提案された構造の有利な変質によって強く影響されることを示唆しています。バインディングのコンカナバリン A、4 量体の形で認められなかったサイト正規ダイマーのダイマー化のためのシールドを示します。結果はまた、糖鎖結合部位から区別される疎水結合サイトの存在を示しています。
コレラ毒素A1サブユニットの立体構造の安定化は、毒素の転位と携帯電話中毒を阻害する
コレラ毒素（CT）は逆行性小胞輸送によって細胞表面から小胞体（ER）に移動します。 CT（CTA1）の触媒サブユニットは、小胞体膜を通過すると小胞体関連分解の品質管理機構を含む過程で細胞質に入ります。この転位イベントの分子の詳細は完全に特徴付けされていない。ここでは、37度C-トリガーは毒素の転位でCTA1三次構造のCTA1ユニット具体的には、損失でその熱的不安定性を報告します。生物物理学的研究はグリセロールが優先的にその二次構造の熱安定性に顕著な影響を与えることなくCTA1の三次構造を安定させことがわかった。 CTA1三次構造の熱無秩序は、通常、二次構造の摂動に先行したが、10％グリセロールの存在下でCTA1三次構造の温度依存による損失がCTA1二次構造の損失とタンデムで、より高い温度で発生しました。 CTA1三次構造のグリセロール誘発性の安定化は、ERからCTA1転位を遮断し、代わりに細胞外培地に分泌CTA1を促進した。これは、順番に、CT中毒を阻害した。グリセロール処理もプロテアソーム20SコアによってCTA1のin vitroでの分解に阻害した。総称して、これらの知見は、毒素の熱不安定性が中毒プロセスの重要な役割を果たしていることを示している。彼らはまた、CTA1三次構造の安定化は、新規な抗毒素治療薬の潜在的な目標であることを示している。
コレラ毒素A1サブユニットの熱安定性へのサブドメイン構造の寄与
コレラ毒素の触媒A1サブユニット（CTA1）の3つの異なるサブドメインを持つADP-リボシルトランスフェラーゼである。CTA1（1）毒素の触媒コアを形成し、CTA1（2）CTA1（1）とCTA1（3）の間に拡張されたリンカです。 、とCTA1（3）コンパクトな球状の領域です。 CTA1は、それが細胞変性効果を開始する細胞質ゾルを入力するように小胞体（ER）膜を横切る。毒素の転座は、小胞体関連分解（ERAD）、輸出はERから細胞質へタンパク質をミスフォールドの品質管理システムが含まれます。 37℃の生理的温度で、フリーCTA1サブユニットは細胞質ゾルへのERAD媒介移行をトリガ部分的に展開コンフォメーションである。したがって、CTA1構造の温度感度は、その機能の重要な決定因子である。ここでは、CTA1の熱変性にCTA1サブドメイン構造の寄与を検討した。生物物理学的測定はCTA1（1）サブドメインが熱的に不安定とCTA1（2）サブドメインがCTA1（1）にコンフォメーションの安定度を提供することであることを実証した。 CTA1（3）サブドメインはCTA1の全体的な安定性に影響を与えませんが、CTA1の熱変性は、CTA1（3）サブドメインの構造の局所損失を開始するために表示されます。グリセロールと酸性pHの両方の完全な熱無秩序を抑制長さCTA1なくCTA1の無秩序は、A1（3）サブドメインを欠いて構築します。これらの観察は、細胞質ゾルへの後続の移行を容易にするイベント、CTA1の熱変性に関するメカニズムの洞察を提供しています。
磁気緩和を用いたコレラ診断のための分子擬態ベースのリガンドの同定
共有適切なリガンドに結合すると、酸化鉄ナノ粒子は、関心のある特定のターゲットにバインドすることができます。この相互作用は、磁気緩和の測定を介したソリューションのスピン - スピン緩和時間の変化（T2）を介して検出することができます。本報告では、分子擬態の戦略は、コレラ毒素Bサブユニット（CTB）に結合するリガンドを標的と識別するために使用されていました。携帯CTB-受容体、ガングリオシドGM1は、ガラクトースとグルコースユニットの部分で構成される五糖部分を含む。そこで我々はCTBは炭水化物共役酸化鉄はこのようにT2緩和時間で検出可能な変化を生成し、GM1模倣物としてナノ粒子を認識するだろうと予測した。磁気緩和の実験では、CTBは、ガラクトースコンジュゲートナノ粒子と相互作用することを明らかにした。この相互作用は、遊離またはナノ粒子コンジュゲートガラクトース分子を用いた表面プラズモン共鳴の研究によって確認されました。ガラクトースコンジュゲートナノ粒子は、40 pMの検出限界を達成するCTBセンサーとして使用された。磁気緩和の研究を通じて、我々はCTBもデキストランでコーティングされたナノ粒子と相互作用することを見出し、表面プラズモン共鳴の研究はまた、この相互作用を確認した。追加実験では、デキストランでコーティングされたナノ粒子はまた、CTBセンサーとして、またデキストランは、GM1発現細胞にCTBの内在化を防ぐことができます使用することができることを実証した。私たちの仕事は、磁性ナノ粒子複合体と磁気緩和の検出が分子擬態を介してリガンドを標的と識別するための簡単かつ迅速な方法として使用できることを示しています。さらに、我々の結果は、デキストランでコーティングされたナノ粒子は、CTBを検出するための低コストのアプローチを表していることを示しています。
治療化学シャペロンは、コレラ中毒とコレラ毒素A1サブユニットのフォールディング/転座を阻害する
コレラ毒素（CT）は細胞表面から酔って、細胞の小胞体（ER）にそのままAB（5）タンパク質毒素として移動します。 ERで、毒素の残りの部分から触媒A1サブユニット解離する。小胞体から細胞質へCTA1の移行は、その後小胞体関連分解（ERAD）の品質管理機構によって促進される。孤立CTA1サブユニットの熱的不安定性は、細胞質ゾルへのERAD媒介トランスのためのトリガーとして機能する展開毒素の立体構造を生成します。本研究では、我々は、4 - フェニル酪酸（PBA）への曝露がCTA1の熱変性を抑制すること。円偏光二色性と蛍光分光法による表示これは、順番に、ERから細胞質ゾルCTA1のエクスポートおよび培養細胞やラット回腸ループのいずれかの生産的な中毒をブロックされています。細胞培養の研究でPBAはホロトキシンからER、CTA1解離のCT売買に影響を及ぼさなかったか、ERADシステムの機能。 PBAは、現在、尿素サイクル異常症を治療する治療薬として使用されます。我々のデータは、PBAはまた、防ぐか、または可能性がコレラを治療するために、新しいアプリケーションで使用される可能性が示唆された。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、A1サブユニットをアンフォールディングせずにホロからコレラ毒素A1サブユニットを変位
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）は、コレラ毒素（CT）の触媒サブユニットA1に対して "unfoldase"活性を示すことが提案されている。 CTA1サブユニットの展開は、CTホロトキシンからそれを変位させると細胞質ゾルへの移行の準備をしていると考えられている。日付に、PDIのunfoldase活動はCTA1以外の基質について実証されていません。 PDIの推定unfoldase活動のための代替説明はCTA1が生理的温度でホロからの分離によって自発的に展開されますことを示している最近の構造研究によって示唆されている。したがって、PDIは、単にCTA1サブユニットを展開することなくCTのホロトキシンからCTA1を取り除くことができます。 CT分解と展開CTA1のPDIの役割を評価するために、我々は、CTホロトキシンからCTA1のPDI-媒介分離を監視するリアルタイムのアッセイを利用して直接同位体編集フーリエ変換によってCTA1構造にPDI結合の影響を調べた赤外分光法。私たちの集団のデータは、PDIが分解CTをホロのために必要とされることを示しているがため、そのホロトキシンからCTA1解離のための新しいメカニズムを暴く、CTA1サブユニットを展開していません。
三次医療センター、北インドでヴァナ抵抗性遺伝子を含むバンコマイシン中間黄色ブドウ球菌菌株を植民地化。
集中治療室におけるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) のための鼻キャリッジ調査に低感受性バンコマイシンを 4 株の MRSA が検出されました。ヴァナ遺伝子これらバンコマイシン中間黄色ブドウ球菌 （VISA） 系統の 2 つが見つかりませんでした。選択的なバンコマイシン圧力の不在で耐性遺伝子の発現につながった可能性が。
