Summary
Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.
Abstract
Es wird immer deutlicher, dass die Elektroporation der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primären Zellen einzuführen. Die Gene Pulser MXcell Elektroporation und Gene Pulser Elektroporation Puffer wurden speziell entwickelt, um Nukleinsäuren in Säugerzellen und schwer zu transfizieren Zellen, wie Primär-und Stammzellen cells.This Video transfizieren demonstriert, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren , und dann bereiten sie für die Elektroporation in den MXcell System. Wir beginnen mit der Isolierung von Ober-und Unterschenkels. Knochenmark aus beiden Ober-und Unterschenkels werden dann geerntet und Kulturen etabliert. Cultured Knochenmarkzellen werden dann transfiziert und analysiert.
Protocol
Harvesting Knochenmark aus Oberschenkel-und Schienbein
- Der erste Schritt des Verfahrens ist es, dem Knochenmark aus dem Oberschenkel-und Schienbein einer 6 Ernte - bis 12-Wochen alten Maus (wir sind mit BALB / c-Mäusen, aber Sie können diesen Vorgang mit jeder Maus-Stamm zu tun). Um zu beginnen, euthanize der Maus durch CO 2-Inhalation (wird nicht angezeigt). Ernte Oberschenkelknochen und Schienbein von den Hinterbeinen eines jeden. Dann, mit einer Rasierklinge geschnitten jedem Ende der Oberschenkel auf die Hüft-und Kniegelenke zu entfernen und bis auf die Knochen freizulegen.
- In ähnlicher Weise geschnitten jedem Ende der Tibia, die Knie-und Sprunggelenk angrenzenden Regionen zu entfernen und bis auf die Knochen freizulegen.
- Nehmen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel und füllen es mit RPMI mit 10% FBS, Penicillin, Streptomycin und beta-Mercaptoethanol (BME = 100 uM) ergänzt. Mit Pinzette, halten Sie die Knochen über eine Petrischale mit RPMI-Medien. Legen Sie die Nadel der Spritze in das eine Ende des Knochens und drücken Sie den Kolben zu spülen, das Knochenmark. Die Kanüle kann auf und ab bewegt im Inneren der Knochen zu spülen verbleibende Knochenmark werden.
- Wiederholen Sie den Vorgang für alle die Knochen, und fahren Sie dann mit Gründung der Kulturen.
Gründung Kulturen
- Zum Aufbau der Knochenmark-Kulturen, die Pipette gespült Knochenmark nach oben und unten mehrmals zum Aufbrechen der Gewebe in einer Zellsuspension.
- Legen Sie einen 70-Mikron-Filter auf einem 50 mL konischen Rohr, und fügen Sie die Zellsuspension auf den Filter.
- Spülen Sie die Petrischale einmal mit RPMI, fügen Sie dann die zu den 70-Mikron-Filter zu spülen.
- Mit dem Gummi Ende einer 1 mL Spritzenkolben, schleifen das Knochenmark Stücke übrigen auf der 70-Mikron-Filter.
- Waschen Sie den Filter einmal mit RPMI.
- Nach dem Waschen der Filter, Zentrifugen der Zellsuspension bei 1200 rpm für 5 Minuten.
- Waschen Sie die Zellpellet durch Resuspendieren in PBS.
- Zählen Sie die Zellen mit Hilfe einer Zählkammer. Wir in der Regel erhalten ~ 90 Millionen Zellen von einer Maus die Knochen (zwei Oberschenkelknochen sowie zwei tibiae). Nach Auszählung der Zellen, Zentrifuge sie wieder bei 1200 rpm für 5 Minuten.
- Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge RPMI und aliquoten sie in Zellkulturflaschen mit RPMI genug, so dass die Endkonzentration 1 Million Zellen pro ml ist.
- Add Zytokine auf die Entwicklung Ihres Zelltyp von Interesse zu fördern. In diesem Fall ist das Zytokin Interleukin-3 (IL-3 = 10 ng / mL) zugegeben, um die Entwicklung von Basophilen und Mastzellen zu fördern. Zum Erwerb Basophile, für 10 Tage bebrüten. Für Mastzellen, für 5 Wochen bebrüten. Bei der Generierung von Mastzellen, die Medien und IL-3 sollte einmal pro Woche gewechselt werden.
- Hier ist ein Blick darauf, wie Mastzellen sollten unmittelbar nach der Beschichtung auftreten. Dieses Bild zeigt die Differenzierung der Mast Knochenmarkzellen in Basophilen und Mastzellen 10 Tage nach der Zugabe von Interleukin-3.
- Sobald die gewünschten Zelltyp erhalten, mit der Elektroporation Schritt fort.
Elektroporation Cells
- Zu Beginn der Elektroporation Schritt bestimmen die Anzahl der Zellen in der Kulturflasche.
- Cells sind typischerweise bei einer Dichte von 10 Millionen pro ml elektroporiert, so übertragen die erforderliche Zellzahl auf konische Röhrchen und zentrifugieren bei 1200 rpm für 5 Minuten.
- Nach dem Zentrifugieren absaugen Medien, waschen Sie die Zellen mit 1X PBS, und Zentrifuge wieder bei 1200 rpm für 5 Minuten.
- Saugen Sie das PBS und fügen Bio-Rad Gene Pulser Elektroporation Puffer, um eine Zellsuspension von 10 Millionen Zellen pro ml zu machen.
- Nach dem Resuspendieren der Zellen, fügen Sie die gewünschten Plasmid-DNA in einer Endkonzentration von 10 bis 20 Mikrogramm pro Milliliter.
- Aliquot 150 Mikroliter der Zellsuspension in die Vertiefungen Ihrer Wahl auf eine 96-Well Platte Elektroporation.
- Legen Sie die Elektroporation Platte in der MXcell Platte Kammer und den Deckel schließen.
- Vor der Transfektion von Mastzellen, muss eine Elektroporation Protokoll in die MXcell es sei denn, mit einem vorgegebenen oder gespeicherte Protokoll programmiert werden. Durch Optimierung Experimenten haben wir herausgefunden, dass die höchste Transfektionseffizienz von Mastzellen kommen mit Rechteckimpuls-Protokolle. Wir werden die Elektroporation Bedingungen auf der Platte zu variieren, um 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms und 350V/10ms Rechteckimpulse bei 2000uF und 1000 Ohm zu liefern. Sobald das Protokoll festgelegt wurde und geladen auf das Gerät, drücken Sie "Pulse", um die Zellen elektroporieren.
- Nach der Elektroporation abgeschlossen ist, übertragen Sie die Zellen einer Gewebekultur Platte. Wir typischerweise Transfer je 150 Mikroliter Elektroporation Probe auf ein gut in einer 48-well Zellkultur-Platte mit 300 Mikroliter RPMI (ergänzt mit 10% FCS, Penicillin, Streptomycin und beta-Mercaptoethanol) mit 10 Nanogramm pro ml Interleukin-3. Die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C, dann analysiert 24 Stunden später für die Expression und Unterdrückung.
Transfection Ergebnisse
Die Fluoreszenz-Mikroskopie Bild der Zellen nach erfolgreicher Elektroporation mit 20 Mikrogramm pro ml GFP-Plasmid ist in dem Video zu sehen. Mit dem MXcell Elektroporationssystem Transfektionseffizienz von ca. 30% erzielt werden kann. Das System ermöglicht Ihnen, die Bedingungen zu Ihrem Transfektionseffizienz zu maximieren variieren, dabei jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen.
Discussion
Da immer mehr genomische Information entsteht und neue Werkzeuge wie siRNA entwickelt werden, hat die Verwendung von physiologisch relevanten Zellen immer mehr an Bedeutung für unser Verständnis der Krankheit Wege, Protein-Protein-Interaktionen und Signaltransduktion weiter. Primäre Zellen werden direkt von Geweben oder Flüssigkeiten gewonnen und in vitro kultiviert. Diese Zellen können in eine Reihe von Möglichkeiten, unter anderem durch die Einführung von exogenen genetischen Materials verändert werden. Es wird immer offensichtlicher, dass der effektivste Weg, um Plasmid-DNA oder siRNA in primäre Zellen einzuschleusen Elektroporation ist.
Elektroporation macht Zellen in elektrische Impulse um vorübergehend erhöhen die Durchlässigkeit der Zellmembran, wodurch exogene Nukleinsäuren in die Zelle eindringen. Diese Methode der Transfektion optimiert, um die Unterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen / Leitungen und somit können an Mastzellen transfizieren werden sowie alle anderen Knochenmark stammende Zellen unterzubringen. Außerdem, im Gegensatz viral-vermittelte Transfektion, Elektroporation ist nicht Grenzen für die Größe der transfizierten DNA, noch erfordert umfangreiche Vorbereitungen. Im Gegensatz zu Lipid-vermittelte Transfektion, Elektroporation kann weniger toxisch sein und nicht in endosomalen Abfangen der transfizierten Nukleinsäure führen.
Bio-Rad hat die MXcell Elektroporation, das speziell für diese Zellen entwickelt. die MXcell können Sie variieren, um Ihre Transfektionseffizienz und die Lebensfähigkeit der Zellen zu maximieren. Um die Transfektionseffizienz zu optimieren und Zelltod, eine Vielzahl von Elektroporation Parameter einschließlich Spannung, können Kapazität, Widerstand, und Pulslänge eingestellt und bewertet werden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | |
| Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |
