Summary
In diesem Protokoll haben wir demonstrieren, wie man ein Mikro-Laufwerk-Array für chronische elektrophysiologischen Ableitungen in Ratten zu fabrizieren.
Abstract
Chronische Aufnahme von großen Populationen von Neuronen ist eine wertvolle Technik für die Untersuchung der Funktion neuronaler Schaltkreise in wach verhalten Ratten. Lightweight Aufnahmegeräte Durchführung einer hochdichten Anordnung von Tetroden ermöglichen die gleichzeitige Überwachung der Tätigkeit der Dutzende bis Hunderte von einzelnen Neuronen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Mikro-Laufwerk-Array mit 21 unabhängig voneinander beweglichen Mikro-Laufwerke. Dieses Gerät wurde erfolgreich von Hippocampus und kortikalen Neuronen in unserem Labor Datensatz verwendet. Wir zeigen, wie eine maßgeschneiderte, 3-D gedruckt Kunststoffboden, dass die Mikro-Antriebe halten vorbereiten. Wir zeigen, wie die einzelnen Mikro-Laufwerke erstellen und wie Sie die komplette Mikro-Laufwerk-Array zu montieren. Weitere Vorbereitung des Laufwerk-Array für die chirurgische Implantation, wie die Herstellung von Tetroden, das Laden von Tetroden in das Laufwerk-Array und Vergoldung, wird in einem nachfolgenden Video Artikel behandelt.
Protocol
- Micro-Drive-Array Überblick
Eine komplette Mikro-Laufwerk-Array besteht aus mehreren Komponenten (Abb. 1):- Ein Computer gestaltete Kunststoff-Basis, 21 unabhängig beweglichen Mikro-Laufwerke besitzt.
- Eine Kanüle an der Unterseite des Sockels, in denen eine Reihe von stationären Tetrode Führungsrohre gesammelt.
- 21 Micro-Laufwerke, tragen jeweils eine Tetrode und die einzeln angesteuert werden mit einer Schraube.
- Eine Elektrode Schnittstellenkarte für die Zusammenschaltung zwischen Tetroden und Vorverstärker.
- Eine schützende Membran (nicht gezeigt. 1)
- In einem voll bestückten Mikro-Laufwerk-Array, hält der Kunststoff-Basis all micro-Laufwerke. Jedes Mikro-Antrieb führt eine einzige Tetrode. Die Tetrode ist elektrisch mit der Elektrode Schnittstellenkarte an der Spitze der Mikro-Laufwerk-Array verbunden ist, und gelangt durch die stationäre Führungsrohr in Richtung des Gehirns auf den Boden des Mikro-Laufwerk-Array zu verlassen. Drehen der Schraube auf jeder Micro-Laufwerk vor-oder zurückgestellt die Tetrode.
- Konstruktion von Kunststoff-Basis
Wir gestalten die Basis der Mikro-Laufwerk in einem 3-D-CAD-Software (SolidWorks). Der Vorteil dieser Inhouse-Design-Prozess ist eine rasche Umsatz und Flexibilität des Designs. In der Wilson-Labor haben wir viele Varianten von diesem Teil auf die spezifischen Anforderungen jedes Experiment orientiert konzipiert. Die 3-D-Modell-Datei ist ein Service-Büro geschickt, wo sie von einem Laser-härtenden flüssigen Harz mittels Stereolithographie gedruckt wird. Turnaround Zeit ist weniger als 2 Tage. Die daraus resultierende Teil ist leicht, wieder verwendbar und können maschinell bearbeitet, um einen Faden zu halten. In diesem Protokoll werden wir ein Laufwerk Basis, die mit einer einzigen Aufnahme vor Ort und die 21 Mikro-Laufwerke hält ausgelegt ist. Der SolidWorks Design-Datei wird auf Anfrage zur Verfügung. - Vorbereitung der Kunststoffsockel
Die Kunststoff-Basis verarbeitet wird, um die Mikro-Laufwerke und die Schrauben aufnehmen, um die Elektrode Schnittstellenkarte und die schützende Membran befestigen. Es ist nicht möglich, zuverlässig drucken glatt durch Löcher in den Kunststoff-Basis, so gestalten wir unterdimensioniert Löcher, dann erweitern sie durch Bohren. Richten Sie den Bohrer mit der Achse der vorhandenen Loch vor dem Bohren mit sehr geringer Geschwindigkeit. Ein variabler Drehzahl / Drehmoment Bohrmaschine funktioniert gut für diese Aufgabe.- Drill der 21 Löcher für die Mikro-Laufwerk Schrauben (Außenring) mit einem # 61-Bit.
- Bohren Sie die 21 Löcher für die Mikro-Laufwerk Stützrohre (Innenring) mit einem # 65-Bit.
- Bohren Sie die Löcher, die verwendet werden, um die Elektrode Schnittstellenkarte und schützende Membran mit einer 1,55 mm etwas anhängen wird.
- Press fit eine Hülse (5 mm lang 20 Ga dünnwandige Edelstahlrohre) in jedem der innere Ring von Löchern mit einer Pinzette oder einer Zange, so dass sie bündig mit dem Kunststoff-Basis. Die Ärmel sorgen für einen reibungslosen Bewegung der Mikro-Laufwerk Stützrohre.
Anschließend werden alle Löcher, die Schrauben halten wird angezapft. In gedruckter Kunststoffe, thread-Gewindeformer Ergebnis in haltbarer als die typischen Themen Gewindebohrer. Diese Art von Leitungswasser erfordert größere Führungslöcher. Mit einem Hand-pin vise an den Wasserhahn halten: - Tippen Sie die Löcher für die Mikro-Laufwerk Schrauben mit einem Hahn, dass die Schraube Größe verwendet wird (M1.2x0.25) und ein Trockenschmiermittel übereinstimmt. Zum Ausrichten der Armatur mit der Pilotbohrung, legen Sie eine Länge von 23 Ga-Schlauch in die Hülse daneben.
- Unsere Kunststoff-Basis-Design verfügt über einen Wasserhahn Starter für jedes Mikro-Laufwerk Schraubenloch um sicherzustellen, dass die ersten Fäden nicht beim Einfädeln beschädigt. Nachdem alle Gewindebohrungen sind, können diese Leitungswasser Vorspeisen leicht abgeknickt mit einer Rasierklinge.
- Tippen Sie die Löcher, dass die Schrauben für die Elektrode Schnittstellenkarte und die Schutzfunktion der Kegel mit einem 1-72 Leitungswasser halten wird.
- Einsetzen der Elektrode Führungsrohre
- Um die Kanüle, dass alle stationären Elektrode Führungsrohre hält, schneiden Sie ein 1,5 cm langes Stück von 13 Ga Edelstahlrohren und Aufrauen der Oberfläche mit einem Dremel Schleifscheibe, um die Haftung von der zahnärztlichen Acryl zu verbessern.
- Legen Sie diese Kanüle in das Loch an der Unterseite des Kunststoff-Basis, stellen Sie sicher, dass es co-linear mit der vertikalen Achse des Antriebs ist, und befestigen Sie es mit zahnärztlichen Acryl-oder Epoxidharz. Lassen Sie 5 bis 7 mm der Kanüle ausgesetzt chirurgische Implantation zu erleichtern.
- Schnitt 21 stationären Elektrode Führungsrohre (flexible Polyimid-Schlauch, Innendurchmesser: 0,0071 ", Außendurchmesser: 0,0116") mit einer Rasierklinge zu einer Länge von 6 cm.
- Feed the Führungsrohre ein zu einer Zeit in die Hülsen an der Spitze des Antriebs Basis und den ganzen Weg durch den Kollektor Kanüle an der Unterseite. Optisch auf Knicke oder übermäßiges Biegen und ersetzen Rohre überprüfen, wenn nötig. Zur Erleichterung der Einführung und parallele Ausrichtung der Tetrode Führungsrohre, kann man mit der ersten Fütterung das ganze Bündel von 21 Führungsrohre bis in den BeginnSammler Kanüle von unten. Dann, eines zu einem Zeitpunkt, zu entfernen ein Führungsrohr aus dem Bündel und ihn von der Spitze des Kunststoff-Basis durch das Loch, dass es hinter sich gelassen in das Bündel.
- Drücken Sie die Führungsrohre nach unten, bis sie nur 1-2 mm von der Spitze des Kunststoff-Basis zu erweitern. Eine kleine Menge von dünnen Sekundenkleber an den Rohren, wie sie dem Sammler Kanüle Ausfahrt, wobei darauf geachtet, keine Leimfluss bis wir in das Ende der Führungsrohre.
- Verwenden Sie eine frische Rasierklinge zu schneiden Sie das überschüssige aus dem Bündel von Führungsrohren am unteren Rand des Kollektors Kanüle.
- Herstellung von Mikro-Antriebe
Jedes Mikro-Antrieb besteht aus einem speziell bearbeiteten Schraube und einem hohlen Stützrohr (Abb. 2). Die Schraube und Stützrohr zusammen, so dass eine Lippe auf die Schraube in Acryl eingebettet ist, befestigt Verlassen Sie die Schraube frei drehen (Abb. 2B). Die Schraube wird in die Kunststoff-Basis versehen, und der Unterstützung Rohr wird dann nach oben oder nach unten getrieben, wenn die Schraube gedreht wird, voran-oder Einfahren des Tetrode, dass es trägt. Zur Erleichterung der Anpassung an die verhalten Tier, ist der Kopf der Schraube in die Form eines halben Zylinders. Erstellen Sie eine benutzerdefinierte Schraubendreher für diese Schraube:- Cut 5 cm von 15 Ga Edelstahlrohren.
- Nehmen Sie eine der benutzerdefinierten Schrauben und abzuschleifen das vorstehende Unterlippe.
- Legen Sie die Schraube in den Schlauch, bis die Spitze der Schraube bündig mit dem Ende des Schlauchs.
- Crush den Schlauch um die Gewinde wieder mit einem Paar Gripzangen so dass die Schraube nicht in Bezug auf die Kanüle zu drehen.
- Verwenden Sie einen Stift Schraubstock, um die benutzerdefinierte Schraubenzieher halten.
Zur Herstellung der Mikro-Laufwerke verwenden wir ein 3-D gedruckt Kunststoff-Formenbau mit kleinen Brunnen (3 mm x 5 mm, 2 mm tief). Jeder Brunnen hat zwei Löcher in die untere Fläche, 2 mm auseinander, für die Unterstützung Rohr und der Schraube angeordnet. Alternativ können Formen aus einem technischen Kunststoff wie Delrin gefertigt werden, unter Verwendung einer Bohrmaschine, die gut und Löcher zu erzeugen. - Bereiten Sie die Form, indem Sie das Loch für die Unterstützung Kanüle mit einem 23 Ga Nadel und tippen Sie das Loch für die Schraube für die Kunststoff-Basis beschrieben, vor.
- Linie der Innenseite der gut mit Teflon-Schmiermittel oder ein dünner Film aus Vaseline, um für die Freigabe der ausgehärteten Dentalmassen Acryl aus der Form ermöglichen ..
- Bewerben Teflon Schmiermittel an einer Schraube und legen Sie sie in die Form mit dem custom made Schraubendreher, bis die Fäden direkt unter dem Boden des Brunnens sind.
- Rauen Sie die oben 2-3 mm einer 14 mm langen Stützrohr (23 Ga Edelstahlrohr) mit einer Schleifscheibe, um die Haftung des zahnärztlichen Acryl zu verbessern. Stecken Sie ihn in der Form, bis die Spitze der Kanüle liegt auf halbem Weg zwischen dem oberen Rand des Brunnens und der Oberseite der Schraube.
- Gießen zahnärztliche Acryl in den Brunnen. Rühren Bewegung wird verwendet, um sicherzustellen, dass die zahnärztliche Acryl in alle Bereiche rund um die Schraube und Stützrohr fließt. Entfernen Sie alle Luftblasen mit einer kleinen Nadel.
- Warten Sie, bis der Zahn-Acryl vollständig geheilt ist (15-30 Minuten) und entfernen Sie dann die Mikro-Laufwerk aus der Form durch Drehen der Schraube gegen den Uhrzeigersinn.
- Es ist wichtig, einen Qualitäts-Check der Mikro-Laufwerke. Überprüfen Sie die ausgehärteten Dentalmassen Acryl auf Risse und / oder Luftblasen, die in der Regel durch zahnärztliche Acryl, die zu dick oder zu dünn war verursacht werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Schraube und das Stützrohr sind parallel zueinander und dass die Schraube dreht sich reibungslos. Schrauben und Stützrohre von Mikro-Laufwerke, die nicht diesen Kriterien kann geknackt frei von den Zahn-Acryl-und recycelt werden.
- Wiederholen Sie die Schritte 5,6 bis 5.11 bis Sie 21 Mikro-Laufwerke haben.
- Die Endmontage der Mikro-Laufwerk-Array
- Lower jedes Mikro-Laufwerk in den Kunststoff-Laufwerk Basis. Jedes Mikro-Laufwerk Stützrohr soll einen reibungslosen Übergang sowohl innerhalb als auch im Ärmel und über seinen stationären Führungsrohr. Vergewissern Sie sich, dass die Führungsrohre nicht aufbiegen, wie die Mikro-Antrieb abgesenkt wird.
- Mit der Mikro-Laufwerke komplett abgesenkt, fügen Sie eine dünne Schicht von dentalen Acryl in das Innere des Laufwerks Ausgangspunkt, um die Elektrode Führungsrohre zu fixieren.
- Beachten Sie, dass die Nichteinhaltung der Mikro-Laufwerke den ganzen Weg vor der Zugabe der zahnärztlichen Acryl niedriger wird in wicking der Acryl bis hin den Ärmeln und Behinderung der Mikro-Laufwerk Bewegung führen.
- Beschriften Sie die Mikro-Laufwerke 1-21.
- Schalten Sie das Laufwerk-Array auf den Kopf und nehmen Sie ein Bild des Bündels von Führungsrohren. Dieses Bild wird verwendet, um den Standort des Führungsrohres, die der jeweiligen Mikro-Laufwerk abzubilden.
- Raise all die Mikro-Laufwerke von mehreren mm.
- Legen Sie eine Polyimid-Trägerrohr (0,005 ") in jedes Führungsrohr aus der Unterseite des Laufwerks Basis. Lassen Sie das Trägerrohr verlängern 1-2 mm von der Spitze der vollständig abgesenkten Mikro-Laufwerk und und notieren auf dem Foto die Identität des entsprechende Micro-drive.
- Kleben Sie dieTrägerrohr für die Mikro-Laufwerk Stützrohr mit 5-Minuten-Epoxy oder Sekundenkleber. Beachten Sie, dass Leim oder Epoxy, die zu dünn ist, wird fließen die Unterstützung Kanüle und behindern freie Bewegung des Mikro-Laufwerk oder, schlimmer noch, fix it, um die Führung Kanüle. Wenn dies geschieht, kann das insbesondere für Kleinst-Antrieb nicht genutzt werden.
- Senken Sie alle Mikro-Laufwerke. Cut alle Trägerrohre bündig an der Unterseite des Kollektors Kanüle mit einem frischen Rasierklinge.
- Zum Schluss die Neuralynx Elektrode Schnittstellenkarte, um das Laufwerk Basis mit zwei Schrauben (Größe: 1-72, Länge: 3 / 16 ").
An diesem Punkt das Laufwerk-Array ist bereit, mit Tetroden geladen werden. Herstellung von Tetroden, wie man sie in der Mikro-Laufwerke zu laden, und wie man das Laufwerk-Array für chirurgische Implantation vorzubereiten sind die Themen einer späteren Video-Artikel.
Abbildung 1. Modell der fertigen Mikro-Drive Array. Ein Mikro-Laufwerk-Array besteht aus mehreren Hauptkomponenten: einer Kunststoff-Laufwerk Basis; ein Sammler Kanüle aus dem die Tetroden ins Gehirn, 21 Mikro-Laufwerke, die jedes Laufwerk eine einzelne Tetrode; eine Elektrode Schnittstellenkarte, die Vorverstärker verbindet.
Abbildung 2. Benutzerdefinierte Mikro-Laufwerk Schrauben. A. Technische Zeichnungen der benutzerdefinierten Schraube Design. Die Schraube ist mit einem Gewindeteil (M1.2x0.25; 1,2 mm Durchmesser, 0,25 mm / Umdrehung)., Eine halbe Zylinderkopf, dass unsere maßgeschneiderten Schraubenzieher und eine glatte Teil mit Lippe (siehe Detail) übereinstimmt B. Modell komplette Mikro-Laufwerk. Das Stützrohr und benutzerdefinierte Schraube mit Zahnzement verbunden. Die Lippe an der Schraube ist in der zahnärztlichen Zement eingebettet und erlaubt eine freie Rotation während der Fahrt das Stützrohr oben oder unten.
Zusätzliche Dateien
Wir haben die gedruckten Fahrbasis, die schützende Membran und die Form für den Bau des Mikro-Laufwerke in SolidWorks 2008 3D-CAD-Software:
- Laden Sie die Datei: DriveBase.sldprt welche Modelle des Antriebs Basis und schützende Membran und Kappe enthält.
- Laden Sie die Datei: MicroDriveMold.sldprt , welches Modell des Mikro-Laufwerk Form enthält
Der 3D-Druck-Service-Büro können nicht mit nativen SolidWorks-Dateien nicht direkt, sondern erfordert die Design-Dateien in der Stereolithographie CAD-Format (STL). Für Menschen, die keinen Zugang zu SolidWorks Software, aber immer noch gerne auf die bedruckten Teile in der Video-Artikel verwendet verwenden wir auch die Ausführungen im STL-Format als auch:
- Laden Sie die Datei: DriveBase.stl , welches Modell der Antrieb Base enthält
- Laden Sie die Datei: MicroDriveMold.stl welches Modell von Mikro-Laufwerk Form enthält
- Laden Sie die Datei: ProtectionCap.stl , welches Modell der Cap für Schutztrichter enthält
- Laden Sie die Datei: ProtectionCone.stl , welches Modell der Schutztrichter enthält
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die allgemeinen Merkmale des Mikro-Laufwerk Bauprozess. Es wurde erfolgreich geändert werden, um Drive Arrays mit mehreren Aufnahmen Ziele oder kleineren Arrays für Aufnahmen in Mäusen zu erzeugen. Neben der Aufzeichnung aus dem Hippocampus, verwenden viele Forscher diese Laufwerke zu kortikalen und subkortikalen Strukturen Ziel. Der Einsatz von längeren Schrauben erforderlich, um von tieferen Hirnstrukturen aufzuzeichnen. Mit umfangreichen Modifikationen an den Antrieb Basis, Antriebe motorisiert meine anstelle von manuell eingeschaltet diejenigen verwendet werden, so dass genauere, remote Tetrode Anpassung (Yamamoto und Wilson, 2008). Customized stationären Führungskanüle Arrangements haben an Stelle des kreisförmigen wichtigsten Kanüle zur räumlichen Kontrolle über die Verteilung der Tetroden in der Hirnrinde und im Hippocampus zu erreichen verwendet worden.
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Acknowledgments
Wir möchten Linus D. Sonne und Jeenah Jung, der den Einsatz von Computer entworfene, 3-D Druck-Laufwerke in unserem Labor für die Aufnahme von Mäusen stammten anzuerkennen. Darüber hinaus möchten wir alle ehemaligen und derzeitigen Wilson Lab Mitgliedern für ihre Beiträge zur Mikro-Laufwerk und Tetrode Technologieentwicklung im Labor bestätigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
