Micro-Array aandrijving voor chronische In vivo Opname: Tetrode Assembly

Summary

In dit protocol hebben we laten zien hoe fabriceren en voorwaarde tetrodes voor gebruik met een micro-drive array, die werd ontworpen voor chronische elektrofysiologische opnames in ratten. Daarnaast illustreren we de laatste fase van de micro-drive-array constructie, die het installeren van de grond draden en een beschermende kegel bevat.

Abstract

De Tetrode, een bundel van vier elektroden, heeft zich bewezen als een waardevol instrument voor het gelijktijdig opnemen van meerdere neuronen in-vivo worden. De differentiële amplitude van de actiepotentiaal handtekeningen over de kanalen van een Tetrode zorgt voor de isolatie van single-eenheid activiteit van multi-unit signalen. De mogelijkheid om nauwkeurig de stereotaxische locatie en diepte van de Tetrode is van cruciaal belang voor het bestuderen van gecoördineerde neurale activiteit in gebieden van de hersenen. In combinatie met een micro-drive array, is het mogelijk om nauwkeurige plaatsing en een stabiele controle van de vele tetrodes in de loop van dagen tot weken. In dit protocol, laten we zien hoe te fabriceren en voorwaarde tetrodes met behulp van elementaire gereedschappen en materialen, de tetrodes installeren in een multi-drive Tetrode array voor chronische in-vivo-opname in de rat, maken aarddraad aansluitingen op de micro-drive array, en Bevestig een beschermende kegel op de micro-drive-array om de tetrodes te beschermen tegen fysiek contact met de omgeving.

Protocol

1. Fabricage van tetrodes

1. Begin van de bouw van een Tetrode door het verkrijgen van een 50 cm lang, polyimide geïsoleerd, ni-chroom draad met een diameter van 12,5 micron kern. Vouw de draad in de helft. Laat je vingers langs het paar om ze te laten aan elkaar kleven. Zorg ervoor dat de twee draden hebben een goed contact gedurende hun gehele lengte.
2. Vouw het paar door die de twee uiteinden samen. Zorg ervoor dat de lus gevormd op de ene kant niet geknikt is. Snijd de vier draden op de niet-lus uiteinde, zodat de vier tips zijn uitgelijnd.
3. Voor de volgende stap, moet u een aangepaste krokodillenklem, een gemotoriseerd draai-apparaat, en een horizontale balk boven de draaiende apparaat. De alligator clip wordt gewijzigd door lijmen een plastic balk aan de onderkant van de clip. Waar de draad tips zijn blootgesteld, bij elkaar klemmen van de vier draden met de gewijzigde alligator clip. Hang de lus van draden boven de horizontale balk. Plaats de alligator clip in de gemotoriseerde podium.
4. Van toepassing zijn 80 met de klok mee draait, gevolgd door 40 tegen wijzers van de klok wendingen om de draad bundel in de loop van ongeveer drie minuten. Deze parameters kunnen worden aangepast aan uw behoeften.
5. Nadat Tetrode draaien is voltooid, smelten samen de draden door verhitting vanuit drie verschillende hoeken met een heteluchtpistool (420 ° C of 790 ° F), met behulp van het midden-lage flow. Voor elke hoek, te beginnen 1-2 cm onder de plaats waar de draad bundel splitst, voert de warmte kanon naar beneden en omhoog naar een 2 cm afstand van de draden voor ongeveer 5 seconden. Wees voorzichtig als hoge temperaturen volledig smelt de isolatie en leiden tot kortsluiting.
6. Nu dat de draden samen gesmolten, verwijder de Tetrode uit het verdraaien apparaat door voorzichtig het opheffen van de alligator clip om de spanning op de Tetrode te verlichten, en snijd de Tetrode de buurt van de alligator clip. Aan de andere kant, snijd de lus, zodat er vier niet-gebonden delen van de draden van gelijke lengte.
7. Vervolgens scheiden de afzonderlijke strengen aan de top door voorzichtig buigen van de draden met een zachte tip pincet.
8. De Tetrode is nu klaar voor het laden in het micro-drive array. Maak er 21 om 25 meer tetrodes en bewaar ze in een stofvrije doos totdat het tijd is voor het laden van Tetrode proces.

2. Het laden van de tetrodes en op de grond draden in de micro-drive-array

1. Om verder te gaan, moet u een complete micro-drive array. Als u nog niet gebouwd is, wordt verwezen naar de video "Micro-drive array voor chronische in-vivo-opname:. Aandrijving fabricage ' In ons ontwerp-plan, zal de Tetrode worden bevestigd aan de ene kant naar connector hardware, en loopt via de polyimide drager buis in de micro-drive, zodat de elektrode tips uit te breiden dan de basis van de micro-drive array.
2. Voordat u begint, bouw een drive houder dat kan de connector raad van bestuur worden bevestigd aan de ene kant, en aan de andere kant, kan worden geklemd door een Panavise. In dit voorbeeld is de aandrijving houder is een molen-max connector gelijmd aan het ene uiteinde van een X-Acto mes handvat (figuur 1c).
3. Houd de Tetrode met zachte getipt pincet en met behulp van een stereoscoop, duw de punt van de Tetrode in de polyimide drager buis van een van de micro-stations. Duw de Tetrode in de buis totdat de individuele elektrode draden zijn dicht bij de connector raad van bestuur aan de bovenkant van de schijf array. Wees niet te knikken of buigen van de draden, want dat zal de Tetrode veroorzaken aan de hersenen gaan in een hoek, in plaats van loodrecht, en zal de integriteit van de Tetrode verzwakken.
4. Voorzichtig voeden het andere uiteinde van de vier draden in hun respectievelijke openingen in de elektrode-interface bord met behulp van soft tip pincet. Nogmaals, vermijd knikken of buigen van de draden. Met alle vier de draden op zijn plaats, druk op de gouden pinnen in hun gaten met een tang die een verkorte onderkaak hebben. Wanneer de pinnen zijn geduwd in het gat, zullen ze strip de draad isolatie en maak een elektrische aansluiting.
5. Voor toekomstige referentie, bijhouden van de mapping tussen de micro-drives en pin positie op de elektrode-interface board.
6. Doorgaan met het laden een totaal van 18 tetrodes. De drie overige micro-stations op de array zal worden gebruikt om de referentie-elektroden huis. Elke referentie-elektrode is gemaakt van een Tetrode dat slechts een van de vier ongebonden draadeinden gebruikt. Om de referentie-elektroden bevestigen, volgt u de laad-procedure, maar hechten slechts een van de vier elektroden aan de respectieve referentie-elektrode pin op de connector boord.
7. Als u van plan multi-site-opnamen, kan het de moeite waard om plannen uit de aansluitingen van de tetrodes aan op de aansluiting raad van bestuur van tevoren. Dit moet het minimaliseren van de mogelijkheid om de verkeerde Tetrode tijdens de experimenten.
8. Zodra Tetrode het laden is voltooid, controleert twee gemalen draden, een voor het dier en een voor de beschermende kegel. Snij een 6 'lang geïsoleerd staaldraad (tekst: 0.005' diameter) en verwijder de 3 mm van de isolatie, met behulp van metalen pincet, uit elk uiteinde van de draad. Knip dan een 4'Lang geïsoleerd staaldraad (tekst: 0.005 "diameter). Verwijder de 3 mm van de isolatie aan de ene kant en 1 cm aan de andere kant.
9. Route van de zes 'aarde draad door het gat aan de zijkant van de micro-drive array en omhoog richting de interface board. Sluit de blootgestelde draad aan op de elektrode-interface bord met een gouden speld op de aangewezen grond gat. Deze draad zal verbinden met de schedel van het dier.
10. Route van de 4 'aardedraad parallel aan de eerder geïnstalleerde aardedraad. Sluit de 3 mm gestripte uiteinde van de elektrode interfacekaart met behulp van een gouden speld op een andere aangewezen de grond gat. Deze draad wordt later aangesloten op een kegel, die zal fungeren als een kleine kooi van Faraday om ruis te verminderen. We zijn nu klaar aansluitdraden en kan gaan met verfijnen van onze tetrodes.

3. Instellen van de lengte van de tetrodes

1. Ons doel in dit proces is om alle tetrodes gesneden, zodat ze zijn iets langer dan de diepte van het doel hersenstructuur. In ons voorbeeld zijn de micro-drives zijn ontworpen voor een maximale verplaatsing van 5-6 mm, voldoende om een ​​groot aantal neocorticale gebieden en de dorsale hippocampus van een volwassen rat te bereiken. De eerste, lagere alle micro-drives, zodat de tetrodes maximaal worden blootgesteld. Tegelijk snijden alle tetrodes om lengtes die ongeveer 5 mm langer dan de gewenste uiteindelijke lengte met behulp van een paar scherpe fijne schaar.
2. Voor de final cut, bereiden een paar gekartelde schaar in een Panavise. Klem een ​​handvat met een lichte hoek naar beneden en met de vertanding naar boven, terwijl de andere handvat hangen.
3. Nu volledig terug te trekken van alle tetrodes in hun gids canule door het draaien van de micro-drives up.
4. Met behulp van een stereoscoop, volledig uit een Tetrode uit de canule. Met behulp van een liniaal, plaatst u de gekartelde schaar op de gewenste afstand van de gids canule. Langzaam en voorzichtig snijd de Tetrode met een vloeiende beweging. Nadat deze Tetrode is doorgesneden, en trek de up micro-drive door de 3-4mm. Herhaal dit proces voor elk Tetrode totdat alle zijn gesneden. Op dit punt ben je klaar voor goud plating.

4. Gold plating van tetrodes en de kwaliteit controleren

Gold plating de nichroom Tetrode draden is van cruciaal belang voor de lange termijn een stabiele opnamen. Het voorkomt corrosie en verbetert de biocompatibiliteit.

1. Het instellen van de impedantie meter in externe mode en de huidige generator in DC check-modus met audio-uitgang (figuur 1d). Raak de twee draden van de huidige generator om de zes mogelijke paren van kanalen binnen elke Tetrode, en gebruik de audio-feedback om te bepalen of korte broek bestaan ​​tussen paren. Als een kort bestaat, weer re-cut van de Tetrode met gekartelde schaar en te testen. Als het probleem zich blijft voordoen, gooi de Tetrode en vervang deze.
2. Wanneer er geen korte broeken bestaan ​​binnen alle tetrodes, verplaatst u alle micro-drives naar beneden, de uitbreiding van alle tetrodes zo ver als mogelijk.
3. Wijzig de configuratie van apparatuur voor het controleren van de impedantie elektrode (Figuur 1e). Nu de uiteinden van alle tetrodes onderdompelen in een bad van standaard gold-plating oplossing. Het goud bad is elektrisch verbonden met de positieve draad van de impedantie meter. Controleer de impedantie van de elektrode door het aanraken van de negatieve draad van de impedantie meter om de corresponderende pin op de connector boord.
4. Meet en noteer de impedantie van elke draad op de micro-drive array. Normale waarden variëren 1-3 MOhm.
5. Op de huidige generator, stelt u de huidige tussen 1-3 uA. Vervolgens stevig bevestigen de negatieve draad van de impedantie meter om de pin op de connector boord. Plaats de apparatuur in de galvanische configuratie (figuur 1f). Op de impedantie meter, snel te schakelen tussen de normale modus, naar de modus bypass, en weer terug. Terwijl in de bypass-modus, zal de huidige door het Tetrode en goud oplossing en goud zal worden uitgeplaat op de elektrode tip. De impedantie na elke ronde in de platen moet lager zijn dan voorheen. Herhaal de huidige puls als de impedantie niet dalen tot onder 1 MOhm. Een conservatieve reeks van acceptabele impedanties 250kOhm tot 350 kOhm. Als de impedantie daalt onder 200 kOhm, kan dit duiden op een kortsluiting.
6. Als na herhaalde pulsen de impedantie niet voldoende laten vallen, kan de elektrode worden belemmerd. Re-snijd de Tetrode, controleren op shorts, en herhaal de gold-plating proces. Als re-cutting niet helpt, vervangt u de Tetrode en opnieuw beginnen.
7. Na plating alle tetrodes kort dip de Tetrode tips in ethanol, en laat ze drogen gedurende 3 tot 5 minuten.
8. Test voor kortsluiting binnen tetrodes behulp van de huidige generator met de Tetrode tips blootgesteld aan lucht. Als er een DC-verbinding bestaat tussen twee of meer elektroden van een Tetrode, de Tetrode, en plaat weer opnieuw gesneden met goud.
9. Na de gold-plating van alle tetrodes is voltooid, voeg een druppel medium dikte van cyano-acrylaat lijm om de interface tussen elke tetrode en de polyimide buizen. Dit zal beveiligde de Tetrode aan de micro-drive en onderhouden van de lengte van de Tetrode.
10. Als laatste stap, verplaatst u alle tetrodes in het station door te draaien aan de schroeven boven.

5. Het aanbrengen van de beschermende kegel

De beschermende kegel heeft tot doel het micro-drives en de blootgestelde Tetrode draad af te schermen van de omgeving. Het biedt ook ondersteuning voor de behandeling tijdens een experiment en vermindert de elektrische ruis. We maken gebruik van een 3-D bedrukte plastic kegel (Referentie Deel I: drive fabricage). Het is echter mogelijk om de kegel te maken van andere materialen, zoals een gebogen stuk van soda kan.

1. Neem de plastic kegel en bevestig wat aluminium folie tape aan de binnen-of buitenkant.
2. Boor vervolgens een klein gaatje (1,5 mm in diameter) door de kegel en losjes een schroef vast met een ring en moer in de kegel. Dit zal dienen als een elektrische doorgang voor de aarddraad. Wij raden u aan een 00-80 grootte schroef en ring combinatie.
3. Plaats eerst en gedeeltelijk drie 1-72 grootte schroeven (3 / 16 centimeter in lengte) om te zetten in de zijkant van de kegel. Met de drive-array opgeschort, plaatst u de conus op het station. Zorg ervoor dat zowel de grond draden uit te breiden van de onderkant van de schijf array. Wikkel de blootgestelde deel van de grond de 4 "draad rond een van de 1-72 schroeven en een paar keer stevig draai de schroef. Zet de kegel om het station te voet door het aandraaien van de overige twee kegel schroeven.
4. Ten slotte neemt u de 1 cm gestripte uiteinde van de korte aarde draad en wind rond de schroef, tussen de folie tape en de ring. Zet de grond door het aandraaien van de schroef. Nu hebben we een micro-drive matrix die is eindelijk klaar voor chirurgische implantatie.

6. Representatieve resultaten

1. Micro-drive-array productie is nu voltooid. Uw micro-drive-array is geladen met 18 tetrodes en 3 referentie-kanalen. Het is ingekapseld in een beschermende kegel en dop voor duurzaamheid. De afgewerkte micro-drive array met beschermende kegel weegt 20g tot 25g gemiddeld.
2. De afgewerkte drive-array is ingeplant met behulp van standaard chirurgische ingreep. Zoals je kunt zien, is de drive aangesloten op een voorversterker chip en een bundel van draden die het signaal dragen naar data-acquisitie hardware en software.

Figuur 1: A) Schematische weergave van Tetrode draaien configuratie. Een horizontale balk schorst de ongebonden elektrode draden van de Tetrode boven de geautomatiseerde Tetrode draaien apparaat. B) Setup voor Tetrode impedantie meting en elektrode plating. Bij het ​​controleren op kortsluitingen, het circuit is anders:. De zwarte draad is aangesloten op een andere elektrode kanaal op de connector bord C) Een close-up van een op maat gemaakt micro-drive-array houder tool. De cilindrische bar is een X-Acto mes hanteren. De connector is een 26-pins, dubbele rij, Mill-max connector. De twee delen zijn met elkaar verbonden met behulp van tandheelkundige acryl. D) Configuratie voor korte controle. Channel X en Y Channel zijn elke twee verschillende kanalen van de vier Tetrode kanalen. E) Configuratie voor het meten van elektrode impedantie. De huidige bron is 'uit'. De impedantie meter is ingesteld op 'aan' en 'test'. F) Configuratie voor goud plating van de elektrode tips. De huidige bron is ingesteld op 'on', is het geluid 'aan', mode is 'unipolaire', DC Test is 'on', is de huidige ingesteld op 2 microamps.

Discussion

Dit protocol is de tweede aflevering van een tweedelige protocol: "Micro-drive array voor chronische in-vivo-opname." De combinatie van de micro-drive array en Tetrode is een krachtig hulpmiddel voor het verkrijgen van gelijktijdige opnames van een groot aantal neuronen in een wakker, gedragen dier voorbereiding. Hopelijk hebben we u met alle noodzakelijke informatie voor u nodig hebt om te beginnen of elektrofysiologische opnames te verbeteren in uw eigen laboratorium.

De gemotoriseerde Tetrode twister apparaat is op maat ontworpen en gefabriceerd. Wij hebben een leverancier en een deel nummer dat u zal toestaan ​​om een ​​apparaat bestellen met vergelijkbare functionaliteit. Als alternatief kan een gemotoriseerd draai-apparaat worden gebouwd in eigen huis eenvoudig door het combineren van een gemotoriseerde roterende staafmagneet met een magnetische roerstaaf die is aangesloten op een alligator clip; deze configuratie zou zeer waarschijnlijk vereisen handmatige telling van rotaties, handmatige omkering van draairichting, en handmatig starten / stoppen.

Sommige elektrode-interface boards hebben geen pin-en-gat mechanismen voor het aansluiten van de elektrode draad. In plaats daarvan, kunt u hebben verkregen een interfacekaart die metalen pinnen die zich uitstrekken van de connector raad van bestuur heeft, zoals metalen pennen zijn vergelijkbaar met die vaak te vinden op standaard elektronische componenten. We kort overzicht van een methodologie voor het aansluiten van de Tetrode kanalen naar metalen pinnen. Verwijder eerst de isolatie aan de uiteinden van de vier elektroden draden van elk Tetrode. Dit wordt bereikt door het toepassen van een vlam aan het uiteinde van elke elektrode zo kort mogelijk met behulp van een handheld butaan toorts. Verkrijgen krimpfolie die gemakkelijk past over de metalen pin, en zal de pin goed knijpen nadat de krimpfolie is verwarmd. Snijd de krimpfolie slang aan op de lengte van de metalen pin. Gebruik capillaire werking om de shrink wrap gevuld met zilveren verf. Steek de punt van een elektrode draad in de krimpfolie. Schuif de shrink wrap over de metalen pin zodanig dat de elektrode draad wordt tussen de pen en de wand van de shrink wrap. Herhaal deze stappen voor de resterende drie elektrode kanalen van de Tetrode. Tot slot, met een side-to-side beweging van een warmte kanon, warmte van de vier pinnen bedekt met krimpfolie (met de elektrode draden in de shrink wrap). Op dit punt, moet u beschikken over stabiele en betrouwbare verbindingen tussen de Tetrode en connector boord.

Gedurende deze fabricage procedures behandelen de elektrode draden met zorg als zeer weinig kracht nodig om ze te beschadigen. Er zijn veel stappen in de Tetrode en micro-drive-array procedure en elke stap is net zo cruciaal als de anderen voor het verkrijgen van gegevens van hoge kwaliteit. Het protocol hier beschreven heeft goed gewerkt voor ons laboratorium gezien de apparatuur beschikbaar. De middelen in uw eigen laboratorium kan anders zijn, dus zorgvuldig overwegen elke stap en aarzel niet om het protocol te wijzigen naar uw eigen eisen en beperkingen voldoen om optimale prestaties te bereiken.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.