Micro-Drive Array עבור כרונית In vivo: Tetrode האסיפה

Summary

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי לשימוש עם מערך מיקרו הכונן, אשר תוכנן עבור הקלטות אלקטרו כרונית בחולדות. בנוסף, אנו ממחישים בשלבים הסופיים של הבנייה מיקרו הכונן מערך, הכולל חוטים הקרקע התקנה חרוט מגן.

Abstract

Tetrode, חבילה של ארבע אלקטרודות, הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור הקלטה בו זמנית של מספר רב של נוירונים ב-vivo. ההפרש משרעת פוטנציאל הפעולה של חתימות על ערוצי tetrode מאפשר בידוד של פעילות יחידה אחת מיחידת רב אותות. היכולת לשלוט במדויק את המיקום ואת עומק stereotaxic של tetrode הוא קריטי לחקר פעילות עצבית מתואמת על פני אזורים במוח. בשילוב עם מערך מיקרו הכונן, ניתן להשיג את המיקום המדויק ושליטה יציבה של tetrodes רבים במשך ימים עד שבועות. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד לפברק tetrodes תנאי שימוש בכלים בסיסיים וחומרים, להתקין את tetrodes לתוך מערך רב כונן tetrode עבור כרוני ב-vivo הקלטה בחולדה, להפוך חוט קשרים הקרקע למערך כונן מיקרו, ואת לצרף חרוט מגן על מערך הכונן מיקרו על מנת להגן על tetrodes מכל מגע פיזי עם הסביבה.

Protocol

1. המצאה של tetrodes

1. בגין בניית tetrode אחד על ידי קבלת 50 ס"מ, polyimide מבודדים, Ni-chrome תיל עם ליבה בקוטר 12.5 מיקרון. מקפלים את החוט לשניים. הפעל את האצבעות לאורך צמד כדי לגרום להם להישאר ביחד. ודא זוג חוטים יש מגע טוב לאורך כל אורכו שלהם.
2. מקפלים את הצמד שוב על ידי מחזיק את שני הקצוות יחד. ודא כי לולאה נוצר בצד אחד אינו מפותל. חותכים את ארבעת החוטים בצד הלא כרך כך ארבעה טיפים מיושרים.
3. עבור לשלב הבא, תצטרך קליפ תנין שונה, מכשיר מפנה ממונע, וכן פס אופקי מעל המכשיר מפנה. קליפ תנין הוא שונה על ידי הדבקת פס פלסטיק לבסיס של קליפ. איפה את הטיפים תיל חשופים, מהדק את ארבעת החוטים יחד עם קליפ תנין שונה. לתלות את הלולאה של חוטים על הבר אופקי. מניחים את קליפ תנין לשלב ממונע.
4. 80 החל השעון מבחינת פיתולים פיתולים ואחריו 40 השעון מבחינת בניגוד צרור את החוט במהלך כשלוש דקות. פרמטרים אלה יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכים שלך.
5. אחרי סיבוב tetrode הושלמה, הפתיל את החוטים יחד על ידי חימום משלוש זוויות שונות עם אקדח חום (420 ° C או 790 ° F), תוך שימוש בינוני נמוך לזרום. עבור כל זווית, להתחיל 1-2 ס"מ מתחת שבו צרור חוט מתפצל, להפעיל את האקדח חום למעלה ולמטה במרחק של 2 ס"מ מן החוטים כ -5 שניות. היזהר כמו טמפרטורות גבוהות לחלוטין להמיס את הבידוד להוביל קצרים.
6. עכשיו החוטים יש התמזגו יחד, להסיר את tetrode מן המנגנון מתפתל בעדינות על ידי הרמת קליפ תנין כדי להקל על המתח tetrode, וחתך את tetrode ליד קליפ תנין. בקצה השני, לחתוך את הלולאה כך יש ארבעה גדילים לא מלוכדות של תיל באורך שווה.
7. בשלב הבא, להפריד בין גדילים בודדים בחלק העליון על ידי כיפוף בעדינות את החוטים עם פינצטה היטה רך.
8. Tetrode מוכן כעת טוען לתוך מערך מיקרו הכונן. בצע 21-25 יותר tetrodes ולאחסן אותם בתוך קופסה אבק חינם עד שהגיע הזמן בתהליך הטעינה tetrode.

2. טעינת tetrodes וחוטי הקרקע לתוך מערך מיקרו הכונן

1. כדי להמשיך, תצטרך מערך שלם מיקרו הכונן. אם לא נבנה עוד אחד, להפנות את הווידאו "מערך כונן מיקרו עבור כרוני ב-vivo הקלטה:. ייצור כונן" בתוכנית העיצוב שלנו, tetrode תצורף בקצה אחד לחומרה מחבר, ולא יפעלו דרך polyimide צינור המוביל כונן המיקרו כזה טיפים אלקטרודה להאריך מתחת לבסיס של מערך כונן המיקרו.
2. לפני שמתחילים, לבנות בעל הכונן יכול להיות מחובר ללוח מחבר בצד אחד, בצד השני, יכול להיות מהודק ידי panavise. בדוגמה זו, בעל הכונן מחבר הטחנה-max מודבק בקצה אחד של הידית X-ACTO סכין (איור 1 ג').
3. החזקת tetrode עם פינצטה היטה רך באמצעות stereoscope, לדחוף את קצה tetrode לתוך polyimide צינור המוביל של אחד מיקרו כוננים. לחצו על tetrode לתוך הצינור עד חוטים בודדים קרובים אלקטרודה ללוח מחבר בראש מערך הכונן. היזהר לא שריטה או לכופף את החוטים, כמו זה יגרום tetrode להזין את המוח בזווית, ולא בניצב, ואת תחליש את שלמות tetrode.
4. בעדינות להאכיל את הקצה השני של ארבעת החוטים לחורים שלהם בלוח אלקטרודה ממשק באמצעות פינצטה היטה רך. שוב, יש להימנע מסתלסל או לכופף את החוטים. עם כל ארבעת החוטים במקום, לדחוף את סיכות זהב לתוך החורים שלהם עם צבת כי יש הלסת התחתונה מקוצר. כאשר הפינים נדחפים לתוך החור, הם רצועת בידוד חוט וליצור חיבור חשמלי.
5. לעיון מאוחר יותר, לעקוב אחר מיפוי בין מיקרו כוננים עמדה פינים על הלוח ממשק אלקטרודה.
6. המשך טעינה כולל של 18 tetrodes. שלושת הנותרים מיקרו כוננים במערך ישמש לבית אלקטרודות התייחסות. אלקטרודה כל התייחסות עשוי tetrode המשתמשת רק אחת מארבע קצות חוט מחוברים. כדי להצמיד את האלקטרודות הפניה, בצע את ההליך טוען לצרף אבל רק אחת מארבע אלקטרודות את הסיכה אלקטרודה בהתאמה התייחסות על הלוח מחבר.
7. אם אתם מתכננים רב אתר הקלטות, זה עשוי להיות כדאי לתכנן את החיבורים בין tetrodes ללוח מחבר מראש. זה אמור לצמצם את האפשרות של התאמת tetrode טועה במהלך הניסויים.
8. לאחר טעינת tetrode הושלמה, לעשות שני חוטים הקרקע, אחד עבור החיה ואחד חרוט מגן. גזור אחד "חוט ארוך פלדה מבודדים (טקסט: 0.005" 6 קוטר) ולהסיר 3 מ"מ של בידוד, באמצעות פינצטה מתכת, מקצה אחד של התיל. ואז לחתוך 4"תיל פלדה מבודד ארוך (טקסט: 0.005 'קוטר). הסרה של 3 מ"מ של בידוד בקצה אחד 1 ס"מ בקצה השני.
9. מסלול חוט הקרקע "6 דרך החור בצד של מערך מיקרו הכונן לכיוון הלוח ממשק. חבר את חוט חשוף הלוח ממשק אלקטרודה עם סיכת זהב ב חור באדמה המיועד. חוט זה יתחבר הגולגולת של החיה.
10. הקרקע כביש 4 "חוט תיל במקביל את הקרקע שהותקנו בעבר. חבר את הקצה הפשיטו 3 מ"מ ללוח אלקטרודה ממשק משתמש סיכת זהב חור נוסף בשטח המיועד. חוט זה יהיה מאוחר להיות מחובר חרוט מגן, אשר ישמש כלוב פאראדיי קטן כדי להפחית את רעש טנדר. אנחנו סיים עכשיו חוטי חיבור יכולה להמשיך עם זיקוק tetrodes שלנו.

3. קביעת אורך tetrodes

1. המטרה שלנו בתהליך הזה היא לחתוך את כל tetrodes כך שהם מעט יותר לעומק את מבנה המוח היעד. בדוגמה שלנו, מיקרו הכוננים מיועדים נסיעה מקסימלית של 5-6 מ"מ, מספיק כדי להגיע לאזורים רבים neocortical ההיפוקמפוס הגבי של חולדה בוגרת. ראשית, נמוך כל מיקרו כוננים כך tetrodes נחשפים מרבית. במקביל לחתוך את כל tetrodes מאמצים כי כ 5 מ"מ יותר באורך הסופי הרצוי באמצעות מספריים חדים בסדר.
2. בשביל לחתוך הסופי, להכין זוג משונן מספריים panavise. קלאמפ ידית אחת עם זווית כלפי מטה קלה עם serrations כלפי מעלה, תוך השארת ידית אחרים תלויים.
3. עכשיו לסגת לחלוטין את כל tetrodes לתוך צינורית המדריך שלהם על ידי סיבוב מיקרו כוננים למעלה.
4. שימוש stereoscope, מלא להאריך one tetrode מתוך הצינורית שלו. שימוש, שליט עמדת מספריים משונן במרחק הרצוי מן הצינורית מדריך. לאט ובעדינות לחתוך את tetrode בתנועה אחת חלקה. אחרי זה tetrode נחתך, למשוך את מיקרו כונן על ידי 3-4 מ"מ. חזור על תהליך זה עבור כל tetrode עד שכל קוצצו. בנקודה זו אתה מוכן ציפוי זהב.

4. ציפוי זהב של tetrodes לבדוק איכות

זהב ציפוי את החוטים tetrode nichrome הוא קריטי עבור הקלטות ארוך טווח ויציב. הוא מונע קורוזיה biocompatibility ומשפר.

1. הגדרת מטר עכבה במצב חיצוני מחולל הנוכחי במצב לבדוק DC עם פלט השמע (איור 1d). מגע שני מוביל של הגנרטור הנוכחי של שישה זוגות אפשרי של ערוצי tetrode בתוך כל אחד, ולהשתמש משוב השמע כדי לקבוע אם קיימת בין זוגות מכנסיים קצרים. אם קיים קצר, מחדש לחתוך את tetrode במספריים משוננת ולבדוק שוב. אם הבעיה נמשכת, לבטל את tetrode ולהחליף אותו.
2. כאשר מכנסיים קצרים בלי שום להתקיים בתוך כל tetrodes, להעביר את כל מיקרו כוננים למטה, הארכת כל tetrodes רחוק ככל האפשר.
3. שנה את תצורת ציוד לבדיקת עכבה אלקטרודה (איור 1e). עכשיו לטבול את קצות כל tetrodes לתוך אמבט של תמיסת ציפוי זהב סטנדרטי. אמבטיה הזהב מחובר חשמלית להוביל החיובי של מד עכבה. בדוק את העכבה של האלקטרודה ידי נגיעה להוביל שלילית של מד עכבה להצמיד המתאים על הלוח מחבר.
4. מדוד ורשום את עכבה של חוט על כל מערך מיקרו הכונן. ערכים רגילה נע בין 1-3 MOhm.
5. על גנרטור הנוכחי, הגדר הנוכחית בין 1-3 μA. בשלב הבא, מאובטח לצרף את ההובלה שלילית של מד עכבה להצמיד בלוח מחבר. הנח את הציוד לתוך תצורת electroplating (איור 1f). על מד עכבה, לעבור במהירות ממצב רגיל, כדי לעקוף מצב, ובחזרה. במצב לעקוף, הנוכחי יעבור tetrode פתרון זהב, זהב יהיה מצופה על קצה האלקטרודה. עכבה אחרי כל סיבוב של ציפוי צריך להיות פחות מבעבר. חזור על הדופק הנוכחי אם עכבה לא לרדת מתחת MOhm 1. מגוון השמרני של עכבות מקובל הן על 250kOhm kOhm 350. אם העכבה יורדת מתחת kOhm 200, זה עשוי להצביע על קצר חשמלי.
6. אם לאחר פולסים חזר עכבה לא טיפה מספיק, קצה האלקטרודה עשוי להיות חסום. Re-לחתוך את tetrode, לחפש מכנסיים קצרים, חוזרים על תהליך ציפוי זהב. אם מחדש חיתוך לא עוזר, להחליף את tetrode ולהתחיל מחדש.
7. לאחר ציפוי כל tetrodes, לטבול את קצות tetrode בקצרה אתנול, ולתת להם להתייבש במשך 3 עד 5 דקות.
8. מבחן קצר מעגלים בתוך tetrodes באמצעות מחולל זרם בקצות tetrode חשוף לאוויר. אם חיבור DC הקיים בין שניים או יותר של אלקטרודות tetrode, מחדש לחתוך את tetrode, צלחת עם זהב שוב.
9. לאחר ציפוי הזהב של כל tetrodes תושלם, להוסיף טיפה של דבק בעובי בינוני cyano-Acrylate לממשק בין כל tetrodאלקטרוני שלה polyimide צינורות. זה יהיה להבטיח את tetrode לנהוג מיקרו שלה ולשמור על אורך tetrode.
10. כצעד סופי, להעביר את כל tetrodes לכונן ידי הפיכת כל מפשל.

5. הצמדת חרוט מגן

המטרה של חרוט מגן הוא מגן מיקרו כוננים חוט tetrode נחשפים מהסביבה. הוא גם מספק תמיכה לטיפול במהלך ניסוי ומפחית רעש חשמלי. אנו משתמשים 3-D קונוס פלסטי מודפס (חלק הפניה אני: ייצור הכונן). עם זאת, ניתן להפוך את הקונוס מחומרים אחרים, כמו חתיכת כפוף סודה יכול.

1. קח את חרוט הפלסטיק לתקן כמה קלטות רדיד אלומיניום על משטח פנימי או חיצוני.
2. לאחר מכן, לקדוח חור קטן (1.5 מ"מ קוטר) דרך חרוט ו רופף לצרף הבורג עם מכונת כביסה אגוז בתוך חרוט. זה ישמש למעבר חוט חשמל עבור הקרקע. אנו ממליצים להשתמש בורג 0-80 גודל שילוב מכונת כביסה.
3. ראשית, להוסיף חלקית סיבוב של שלוש ברגים בגודל 1-72 (16/03 ס"מ אורך) אל צידי חרוט. עם מערך הכונן מושעה, הכנס את חרוט על הכונן. ודא שני חוטים הקרקע להאריך מהחלק התחתון של מערך הכונן. לעטוף את החלק החשוף של חוט האדמה '4 סביב אחד הברגים 1-72 כמה פעמים להדק את הבורג בחוזקה. אבטח את חרוט לבסס את הכונן על ידי הידוק שני הברגים הנותרים חרוט.
4. לבסוף, לוקחים את 1 ס"מ של חוט סוף הפשיטו את הקרקע קצר רוח אותו סביב הבורג, בין הקלטת לסכל מכונת כביסה. אבטח את הקרקע על ידי הידוק בורג. עכשיו יש לנו מערך מיקרו הכונן כי הוא סוף סוף מוכן להשתלה כירורגית.

6. נציג תוצאות

1. Micro-כונן מערך הייצור הושלמה. מערך מיקרו הכונן שלכם היא עמוסה 18 tetrodes ו 3 ערוצי התייחסות. הוא עטוף חרוט כובע המגן על עמידות. מערך סיים מיקרו הכונן עם חרוט מגן שוקל 20 גרם עד 25 גרם בממוצע.
2. מערך הכונן סיים הוא מושתל באמצעות הליך כירורגי רגיל. כפי שניתן לראות, הכונן מחובר שבב מגבר קדם ואת צרור של חוטים שמעבירים את האות חומרה רכישת נתונים ותוכנה.

איור 1: סכמטי) של תצורת פיתול tetrode. פס אופקי משהה את החוטים לא מחוברים אלקטרודה של tetrode מעל התקן tetrode אוטומטיות פיתול. B) הגדרת למדידת עכבה tetrode ו ציפוי האלקטרודה. כאשר בדיקת קצרים, מעגל שונה:. החוט השחור מחובר לערוץ אחר אלקטרודה על הלוח מחבר C) תקריב של מנהג עשה כונן מיקרו בעל כלי המערך. סרגל גלילי הוא לטפל X-Acto סכין. המחבר הוא 26 פינים, שורה כפולה, מיל-max מחבר. שני החלקים מחוברים יחד באמצעות אקריליק שיניים. D) תצורת לבדיקת קצר. ערוץ X ו-Y הם כל ערוץ שני ערוצים שונים של ארבעה ערוצי tetrode. E) תצורת למדידת עכבה האלקטרודה. המקור הנוכחי הוא 'כבוי'. מטר עכבה מוגדר 'על' ו 'מבחן'. F) עבור תצורת ציפוי זהב של טיפים אלקטרודה. המקור הנוכחי מוגדר 'על', הוא שמע "על", מצב זה 'חד קוטבי ", מבחן DC היא' על ', הנוכחי מוגדר 2 microamps.

Discussion

פרוטוקול זה הוא הפרק השני של פרוטוקול חלק שני: "Micro-כונן מערך עבור כרוני ב-vivo ההקלטה." השילוב של מערך הכונן מיקרו tetrode הוא כלי רב עוצמה להשגת הקלטות סימולטני של נוירונים רבים ער, מתנהג הכנה של בעלי חיים. יש לקוות, סיפקנו לכם את כל המידע הדרוש תצטרך להתחיל או לשפר את הקלטות אלקטרו במעבדה שלך.

המכשיר tetrode ממונע מסלף היה מנהג תוכנן מפוברק. סיפקנו מספר ספק וחלק שיאפשר לך להזמין מכשיר עם פונקציונליות דומה. לחילופין, המכשיר מפנה ממונע יכול להיות בנוי בתוך הבית פשוט על ידי שילוב של מגנט מסתובב בר ממונע עם מוט בחישה ממוגנטים כי מצורף קליפ תנין; בתצורה זו, קרוב לוודאי, דורשים ספירה ידנית של סיבובים, היפוך כיוון סיבוב ידני, וידני מתחיל / לעצור.

חלק ממשק לוחות אלקטרודה אין פינים ו-חור מנגנונים לחיבור חוט האלקטרודה. במקום זאת, יתכן שהשגתם הלוח ממשק כי יש סיכות מתכת להאריך את מהלוח מחבר: סיכות מתכת אלה דומים לאלה שנמצאו לעתים קרובות על רכיבים אלקטרוניים סטנדרטיים. אנו קצר המתאר מתודולוגיה לחיבור ערוצי tetrode על סיכות מתכת. ראשית, להסיר את הבידוד על קצות ארבעת החוטים של tetrode כל אלקטרודה. מטרה זו מושגת על ידי החלת הלהבה לקצה כל אלקטרודה בקצרה ככל האפשר באמצעות לפיד בוטאן כף יד. השג לכווץ לעטוף שיתאים בקלות מעל הסיכה מתכת, יהיה לסחוט את הסיכה בחוזקה לאחר לעטוף להתכווץ כבר מחומם. חותכים את צינורות לעטוף להתכווץ אורך פין המתכת. השתמש פעולה נימי למלא את לעטוף להתכווץ בצבע כסף. הכנס את קצה חשוף של חוט אחד אלקטרודה לתוך לעטוף את להתכווץ. החלק בעדינות את לעטוף להתכווץ על סיכת מתכת כזה תיל אלקטרודה הוא בין הפינים לבין הקיר של לעטוף את להתכווץ. חזור על שלבים אלה עבור שלושת הערוצים הנותרים אלקטרודה של tetrode. לבסוף, עם תנועה מצד אל צד של אקדח חום, החום ארבע סיכות מכוסה לעטוף להתכווץ (עם חוטי אלקטרודה בתוך לעטוף את להתכווץ). בשלב זה, אתה צריך קשרים יציבה ואמינה בין tetrode ועל הלוח מחבר.

במהלך ייצור נהלים אלה להתמודד עם חוטי אלקטרודה עם טיפול כמו מעט מאוד כוח נדרש להם נזק. ישנם צעדים רבים tetrode ומיקרו כונן נוהל מערך וכל צעד חיוני כמו האחרים לקבלת נתונים באיכות גבוהה. פרוטוקול המתואר כאן עבד היטב במעבדה שלנו בהתחשב ציוד זמין. המשאבים במעבדה שלך עשוי להיות שונה, אם כן, לשקול כל צעד בזהירות אל תהססו לשנות את הפרוטוקול כדי לענות על הדרישות שלך ואילוצים על מנת להשיג ביצועים אופטימליים.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.