Summary
В этой статье описывается протокол, используемый для исследования самонаведения гемопоэтических клеток в свои ниши в костном мозге.
Abstract
Homing это явление, когда трансплантировали гемопоэтические клетки способны совершать поездки и прививать или установить место жительства в костном мозге. Различные chemomkines и рецепторы вовлечены в самонаведения гемопоэтических стволовых клеток. [1, 2]
В настоящем документе излагается классическая самонаведения протокол, используемый в исследованиях гемопоэтических стволовых клеток. В целом это предполагает выделение клеточной популяции которого самонаведения должна быть исследована, окрашивание этой группе населения с красителем интересов и инъекционных эти клетки в кровь из животного-реципиента. Животного-реципиента затем приносили в жертву на заранее заданный промежуток времени после инъекции и костного мозга для оценки процент или абсолютное число клеток, которые являются положительными для красителя интересов. В одной из наиболее распространенных экспериментальных схем, самонаведения эффективность гемопоэтических клеток от двух генетически различных животных (диких животных типа и соответствующие нокаут) сравнивается. В этой статье описывается гемопоэтических самонаведения протокол в рамках таких как эксперимент.
Protocol
- Мы начинаем эксперимент самонаведения, извлекая клетки, которые будут использоваться в эксперименте. Для этого течения эксперимента мы заинтересованы в поиске, если самонаведения целых костного мозга ниши в длинных костях получателя животных различна для клеток костного мозга извлекается из WT животных, таких как C57BL/6J (WT) и те, которые являются трансгенными нокаутами для Lysophosphatidic рецепторов 1 (LPAR1) (KO).
- Прежде чем мы начнем эксперимент, мы будем собирать материалы нам нужно для этого эксперимента. В нашей лаборатории все мыши вскрытия проводятся в ткани ламинарным потоком капота культуры особенно если клетки будут пересажены в животного-реципиента, а не используется для бывших естественных условиях анализа. Начнем с размещения синий лист внутри капота. Другие объекты, необходимые включают пару щипцов и резкое ножницами, которые были в автоклаве, стерильных одноразовых скальпеля и спиртовые тампоны. Нам потребуется изменение PBS и стерильные 6 лунками, миномет, пестик, 50cc синий превысила конической трубе и 70uM одноразовый фильтр.
- Мы начнем с того, один и один WT KO мыши.
- Эти мыши эвтаназии СО 2 вдоха и затем погружают в 70% isopropranolol течение 5 секунд. Этот шаг предотвращает загрязнение клетки интересов с мышью меха и в наших руках, не привело к какой-либо компромисс в выход клеток или экспериментальных результатов.
- Мышей затем расчлененный, в свою очередь с помощью пары щипцов и острые ножницы. Обычно мы начинаем с WT мышь, как рутинной. Небольшой надрез выполнен в вентральной кожи мыши вышележащих живота и кожа растягивается, то использование рук. Кожа сходит задние конечности легко. Бедра и голени извлекаются осторожно, чтобы не сместить головки бедренной кости, как он содержит большое количество костного мозга. Верхних конечностей отделены от туловища животного путем простого применения тягу к ним, сохраняя при этом туловище неподвижным. При этом удаляются верхние конечности, как одно целое. Плечевой кости извлекаются из верхних конечностей.
- Удалены кости находятся в модифицированной PBS, который был добавлен к 6 и пластин. Измененный PBS производится путем добавления 2 мл тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мл 0,5 М ЭДТА PH8. Это решение затем фильтруют через Nalgene 0,45 мкм фильтр и может храниться при температуре 4 градуса по Цельсию, по крайней мере месяц.
- Важно, чтобы маркировать скважин в пластину для того, чтобы быть в состоянии идентифицировать WT и КО кости правильно.
- Мышь туш удаляются и утилизируются.
- Новый лист помещается в капот и кости чистить с помощью одноразовых скальпеля.
- Очищать кости располагаются одна мышь на время в раствор. Два мл PBS изменение добавляется в раствор и кости дробятся помощью пестика. Важно, чтобы первый фрагмент кости по 10 туда-сюда движений пестиком, а затем стереть в порошок их круговыми вращательными движениями. Я обычно делаю 50 по часовой стрелке, затем против часовой стрелки, 50 движений и так далее, пока материал остается в раствор имеет белый цвет и изменение PBS добавлен материал остается белым или прозрачным.
- После каждого набора из 50 круговых движений дробления, мы будем передавать жидкость из раствора в 70 мкМ фильтре, расположенном на вершине 50 мл коническую трубку. Не забудьте добавить 2 мл PBS, чтобы раствор после каждой передачи фильтра. Вы же не хотите, чтобы попытаться стереть в порошок сухие кости или оставить их сухими в течение длительного времени, так как это приведет к апоптозу клеток.
- Как только материал в раствор становится белым, материал фильтра передается в ступке и дробления снова выполняется. Это гарантирует, что клетки в фильтр не были потрачены впустую. Обычно это занимает один или два комплекта круговые вращательные движения, чтобы снова сделать материал в раствор белого цвета, на которой время извлечения клеток является полным.
- Раствора в конической трубе теперь центрифугировали (пожалуйста, не забудьте сохранить клетки WT и КО мыши отдельно. Следовательно, вы будете иметь два различных трубах (один с WT клеток, другие с клетками KO). Центрифуга при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут.
- Аспирируйте от супернатанта с использованием отдельных пипетки аспиратор для каждой трубки. Добавьте 2 мл буфера для лизиса ACK для каждой таблетке. Это лизис буфера должны быть стерильными. Инкубировать на льду в течение 5 минут.
- Добавить 8 вв модифицированных PBS в каждую пробирку. Возьмите 10 мкл из каждой пробирки и пипетки на два отдельных скважин в 96 ячейках. Место труб в центрифуге и спина их при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут.
- В то время как трубы спиннинг, добавить 30 мкл tryphan синего красителя и 60 мкл PBS изменение в каждую лунку 96-луночный планшет, который несет клетки интерес.
- Добавьте 10 мкл этой смеси (пожалуйста, хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз), чтобы гемоцитометра и считать клетки в четыре внешних квадратов.
- Подсчет клеток в каждой пробе на мл является количество клеток таким образом рассчитывал разделить на 4 и multiplieг на 100 000.
- После центрифугирования завершения удаления труб из центрифуги и ресуспендирования клеток в ФСБ без кальция, магния или L глутамина в концентрации 20 млн. клеток на мл. Вы, вероятно, около 5 мл объема для WT и 5 мл объема для животных нокаутом. С этого шага вперед мы будем использовать PBS, не изменяется PBS для протокола.
- Для каждой пробирки добавить DII, краситель ячейки окрашивания, для достижения конечной концентрации 5um. Vortex сразу на 10 секунд. Инкубировать при температуре 37 градусов в течение 10 минут и избегать воздействия света.
- Заполните трубы с PBS и спина в течение 10 минут при 1200 оборотах в минуту.
- После центрифугирования супернатант аспирации и ресуспендирования клеток в PBS в 40 миллионов клеток на миллилитр.
- Нагрузка 500 мкл в 1 мл шприца с иглой 27G (5 шприцев для WT мыши и 5 шприцев для мышей KO). Это может быть разумным подготовить 6 шприцов для каждой когорты. Имея одну дополнительную может помочь как хвостовую вену инъекции, которые мы собираемся делать дальше, может быть сложнее.
- Обложка шприцы с фольгой, чтобы сохранить DII от распада.
- Inject 500 мкл Смесь клеток в каждую животного-реципиента; (5 для каждой группы).
- Эти животные должны быть облученным с 9 Гр облучения 4-24 часа до инъекции.
- 48 часов после инъекции, урожай костного мозга от задних конечностей каждого животного-реципиента.
- Процесс, как описано выше, для доноров. Ресуспендируют клетки от каждого животного в 1 мл PBS. Получить клеток использованием hemacytometer.
- Читайте на поток ЛСР II цитометр из БД или эквивалентный инструмент. Результат может быть выражен как процент или абсолютное количество клеток в костном мозге проанализированы которые DII положительным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Homing является процесс, при котором клетки костного мозга, в том числе стволовых клеток, клеток-предшественников и дифференцированных клеток, их путь в костном мозге после введения в поток крови или костного мозга полость мышей. Как видно из определения, ученый может выбрать для изучения самонаведения гемопоэтических стволовых клеток, клеток-предшественников или дифференцированные клетки определенных иммунофенотипирования и изолированы от сортировки клеток. Обычно ученые вводят клеток костного мозга для обедненного линии маркеров и, следовательно, обогащенные для предшественников и стволовых клеток.
Доза клетки интерес вводится переменная в этом эксперименте. Количество клеток может варьировать от 500 000 на одного получателя мыши до 20 миллионов в получателями мыши. Чем больше клеток можно вводить легче обнаружение в костном мозге. Наличие сотовый номер может ограничить количество инъекций. Сортировка 20 миллионов ЛКС SLAM клетки крайне сложно, возможно, даже непрактичным с современными технологиями в большинстве лабораторных условиях, в случае чего можно было бы принять решение об использовании количество клеток по отношению к нижней части диапазона, приведенные выше.
Шланг животных, в которых самонаведения изучается также могут быть разнообразны. Это животного-реципиента могут быть мыши WT C57BL/6J который был смертельно облученных с 9 Грейс излучения, как мы делали в этом эксперименте, мыши WT C57BL/6J или W / Wv мыши, которые не были облучены. Ли мышь облученных или нет, зависит от вопроса экспериментатор пытается ответить. Если кто-то заинтересован в изучении самонаведения в условиях, когда большое количество цитокинов в настоящее время выпущен и сосудистой утечки, вынуждающие, облученные мыши WT является подходящим выбором. Меньшее количество клеток (500 000) может быть введен в WT мышь, которая не была облученные, так что стволовые клетки могут домом для небольшого числа незанятых ниш, не выше факторы.
W / Wv мышей являются несовершенными в с-KIT рецептор функции и может прививать стволовых клеток без каких-либо предварительной подготовки. Это позволяет нам изучать самонаведения стволовых клеток в отсутствии повреждения сосудов или цитокина, вызванных радиацией. Логистические проблемы с использованием этих мышей является то, что трудно получить достаточное число мышей WWV в качестве получателей из-за размножения колонии касается размера.
Короче говоря, хотя мы описываем стандартный самонаведения протокол, используемый вариации зависит от вопроса, требующие ответа и должны быть определены в ходе проектирования эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Этот протокол был протестирован и оптимизирован в лаборатории д-ра Дэвида Скадден. Финансирование предоставляется Дана Фарбер институт рака / Massachusetts General Hospital клинической гематологии и онкологии Fellowship Program.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E.
Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).