Summary
이 문서는 골수에서 틈새에 조혈 세포의 추적을 연구하는 데 사용하는 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
호밍는 이식 조혈 세포와 합치다 여행이나 골수에 거주를 설정하실 수 있습니다 약자 현상입니다. 다양한 chemomkines과 수용체는 조혈 줄기 세포의 유도에 관여하고 있습니다. [1, 2]
본 논문은 조혈 줄기 세포 연구에 사용되는 고전적인 추적 프로토콜을 설명합니다. 일반적으로 이것은 누구의 추적 조사 요구되는 세포 인구를 분리 관심 염색이 인구가 얼룩과받는 동물의 혈류에 이들 세포를 주입이 포함됩니다. 받는 동물은 다음 주입 및 비율이나 관심의 염색에 대한 양성 세포의 절대적인 번호에 대한 평가 골수 후 미리 정해진 시간에 희생됩니다. 가장 일반적인 실험 계획, 두 유전자 별개의 동물로부터 조혈 세포 (야생 동물 유형 및 해당 노크 아웃)의 위치 추적 효율 중 하나에 비교됩니다. 이 문서는 실험과 같은 내용의 프레임 워크에있는 조혈 세포 유도 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
- 우리는 실험에 사용되는 세포를 추출하여 유도 실험을 시작합니다. 받는 동물의 긴 뼈와의 틈새로 전체 골수의 위치 추적 이러한 C57BL/6J (WT)로 WT 동물에서 추출한 골수 세포에 대해 서로 다른 있으며, 유전자 변형되는 이러한 경우이 현재 실험을 위해 우리는 밖으로 찾는 데 관심이있다 Lysophosphatidic 수용체 1 (LPAR1) (KO)에 knockouts.
- 우리가 실험을 시작하기 전에, 우리는 우리가이 실험에 필요한 자료를 수집합니다. 세포 대신 전 생체내 분석에 사용되는받는 동물에 이식 될 특히 우리가 실험실에서 모든 마우스 해부는 층류 조직 문화 후드에서 수행됩니다. 우리는 후드 안쪽에 파란색 시트를 삽입하여 시작합니다. 필요한 다른 개체는 포셉 한 켤레와 autoclaved되었습니다 가위 날카로운 쌍, 살균 일회용 메스와 알코올 면봉을 포함합니다. 우리는 수정 PBS 및 살균 6 자 번호판, 절구가 필요합니다, 유봉, 50cc 청색 원뿔 관과 70uM 일회용 필터를 얹은.
- 우리가 하나 WT 한 KO 마우스를 복용하여 시작합니다.
- 이 생쥐는 CO 2 흡입에 의해 euthanized 후 5 초 동안 isopropranolol 70%에 담근 수 있습니다. 이 단계는 마우스 모피와 우리 손에 관심 세포의 오염이 셀이나 실험 결과의 수율에 타협을 주도하지 않은 것을 방지할 수 있습니다.
- 생쥐는 다음 포셉와 날카로운 가위를 사용하여 차례로 해부하고 있습니다. 우리는 일반적으로 일상의 문제로 WT 마우스로 시작합니다. 작은 싹둑는 복부와 피부가 다음 손을 사용 늘어입니다 overlying 마우스의 복부 피부에 이루어집니다. 피부는 쉽게 뒷다리 사지에서 온다. 대퇴골과 경골은 다음이가 골수의 대량 포함되어 대퇴골의 머리를 이동시키다하지 돌보는 압축이 풀립니다. 위쪽 팔다리는 몸통이 고정되어 유지하면서 단순히 그들에게 견인을 적용하여 동물의 몸통에서 분리됩니다. 이것은 한 조각으로 상부 사지를 제거합니다. humeri 그런 다음 상단 사지에서 추출됩니다.
- 삭제 뼈가 여섯 잘 접시에 추가되었습니다 수정하는 PBS에 배치됩니다. 수정 PBS는 열 inactivated 태아 소 혈청과 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5 M pH8 2 CC 2 ML를 추가하여 이루어집니다. 이 솔루션은 다음 Nalgene 0.45 음 .. 필터를 통해 여과되고 최소한 한 달 동안 섭씨 4 도에 저장할 수 있습니다.
- 그것은 정확하게 WT와 KO 뼈를 식별하기 위하여 접시에있는 우물에 레이블을하는 것이 필수적입니다.
- 마우스 주검이 제거되고 해제 처리됩니다.
- 새로운 시트는 후드에 배치되고 뼈는 일회용 메스를 사용하여 청소합니다.
- 청소 뼈가 절구에 한 번에 하나의 마우스를 위치하고 있습니다. 수정 PBS의 두 ML은 절구에 추가되고 뼈는 유봉을 사용하여 조각하고 있습니다. 그것은 10과 함께 다음과 유봉의 서있는 움직임과 뼈가 원형 회전 움직임으로 그들을 격파 첫번째 조각하는 것이 중요합니다. 난 보통 시계 방향으로 50, 50 다음 시계 반대 방향으로 운동을하고 그래서 절구에 남아있는 자료는 색상과 수정된 PBS에 흰색 때까지 계속 흰색 또는 투명 남아있는 자료에 추가됩니다.
- 50 원형 파쇄 움직임의 모든 설정하면, 우리는 박격포에서 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치 70 음 필터 액체를 전송합니다. 필터마다 전송 후 박격포에 PBS 2 ML을 추가하는 것을 잊지 마십시오. 당신은이 세포의 apoptosis에 이끌로 시도하고 격파 마른 뼈를 또는 시간의 기간 동안 그들이 건조두고 싶지 않아.
- 절구에 자료가 흰색이됩니다되면, 필터의 재질은 박격포로 전송되고 분쇄 다시 수행됩니다. 이것은 필터에있는 세포가 낭비되지 않도록 보장합니다. 보통 그것은 다시 세포의 추출이 완료되는 시점 색상의 박격포 흰색의 소재를 만들기 위해 원형 회전 운동 중 하나 또는 두 세트 걸립니다.
- 원뿔 튜브의 솔루션은 이제 (주십시오 WT와 KO 마우스 별도의 세포를 유지하는 기억 해요. 따라서 당신이 10 1,200 rpm으로 두 개의 다른 튜브 (KO 세포와 WT 세포와 함께 한 다른). 원심 분리기를해야합니다 centrifuged입니다 분.
- 각각의 튜브에 대해 별도의 흡인기의 pipettes를 사용하여 표면에 뜨는를 대기음. 각각의 펠렛에 ACK 용해 버퍼 2 참조를 추가합니다. 이 용해 버퍼 멸균해야합니다. 5 분 얼음에 품어.
- 각각의 튜브에 수정된 PBS 8 CC를 추가합니다. 96 잘 접시에 두 개의 별도 우물로 10 각 튜브의 UL과 피펫을 가져가라. 원심 분리기에 튜브를 삽입하고 10 분 동안 1,200 rpm으로 그들을 스핀.
- 튜브가 회전하는 동안 관심의 세포를 지니고 있던 96 잘 접시의 각각 잘하는 tryphan 청색 색소의 30 UL 및 수정된 PBS 60 UL를 추가합니다.
- hemocytometer이 혼합 10 UL (최대 아래로 pipetting으로 잘 섞어주세요) 추가하고 네 가지 바깥 광장에있는 세포를 계산합니다.
- ML 당 각 샘플의 셀 개수는 4 multiplie로 나눈 따라서 계산 세포의 숫자입니다100 000에 의해 D.
- 원심 분리가 완료되면, 원심에서 튜브를 제거하고 ML 당 20,000,000 세포의 농도에서 칼슘, 마그네슘 또는 L의 글루타민없이 PBS에 세포를 resuspend. 당신은 가능성 KO 동물에 대한 WT 볼륨 5 ML에 대한 볼륨 약 5 ML을 것입니다. 이 단계 이후에 우리는 프로토콜 PBS를 수정하지 PBS를 사용합니다.
- 각각의 튜브를 추가하려면 DiI, 세포 얼룩의 염료는 5uM의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 10 초 즉시 와동. 10 분 37도에서 부화하고 불빛에 노출하지 마십시오.
- 1,200 rpm으로 10 분간 PBS와 스핀으로 튜브를 입력합니다.
- 원심 분리 후, 뜨는을 기음과 ML 당 40,000,000 세포에 PBS에 세포를 resuspend.
- 27G 바늘 (WT 마우스 및 KO 마우스 5 주사기 5 주사기) 1 CC의 주사기로 500 UL을로드합니다. 그것은 각 코호트 6 주사기를 준비하는 신중한 수 있습니다. 우리가 다음에 할 건데 꼬리 정맥 주사가 힘들 수 있으므로 여분의 하나가 도울 수 있습니까.
- 험악에서 DiI을 유지하기 위해 호일로 주사기를 커버.
- 각받는 동물로 세포 혼합물 500 UL을 주사, (각 코호트 5).
- 이 동물은 4-24시간 전에 분사에 방사선 조사의 9 쥐와 함께 조사해야합니다.
- 주사 후 48 시간, 각받는 동물의 뒷다리 사지에서 수확 골수.
- 기증자에 대한 위에 설명된대로 처리합니다. PBS 1 CC의 각 동물의 세포를 Resuspend. hemacytometer를 사용하여 셀 개수를 구합니다.
- BD에서 LSR II 흐름 cytometer 또는 이에 상응하는 악기를 읽어 보시기 바랍니다. 결과는 DiI 긍정하는 분석 골수의 비율이나 세포의 절대 숫자로 표현할 수있다.
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Discussion
호밍는 과정입니다 의하여 줄기 세포, 전구 세포와 차별화된 세포, 혈액 스트림 또는 마우스의 골수 캐비티에 주입 후 골수에 그들의 방법을 포함하여 골수 세포. 정의에서 분명로서, 과학자가 조혈 줄기 세포, 전구 세포 또는 immunophenotyping으로 식별 및 세포 분류에 의해 격리 차별화된 세포의 위치 추적을 공부하기로 수도 있습니다. 일반적으로 과학자들은 혈통 마커에 대한 고갈 골수 세포를 주입하고 따라서 시조와 줄기 세포에 대한 풍부.
관심 주입의 세포의 선량이 실험의 변수입니다. 세포의 수는 500 000에서받는 마우스마다받는 마우스 당 20 만 다를 수 있습니다. 더 많은 세포가 하나는 골수에서 쉽게 검색을 주입하실 수 있습니다. 휴대폰 번호 가용성은 주입 수를 제한할 수 있습니다. 20000000 LKS 슬램 세포를 정렬하면 하나 이상의 지정된 범위의 하단으로 세포의 숫자를 사용하기로 결정 수있는 경우에 대부분의 실험실 설정에서 현재의 기술과 심지어 허무 아마 매우 어렵습니다.
공부중인 유도하는 호스 동물도 다양 수 있습니다. 이받는 동물은 우리가이 실험 WT C57BL/6J 마우스 또는 조사되지 않은 W / WV 마우스처럼 lethally 방사선 9 그레이스로 조사되었습니다 WT C57BL/6J 마우스 수 있습니다. 마우스는 조사 또는 실험자 대답하려고하는 문제에 따라 다릅니다 여부. 하나 크린 시토킨 많은 양의가 출시되고 있으며, 혈관 누출이 유발되는 설정에 들어가고 공부에 관심이있다면, 조사 WT 마우스는 적절한 선택이 될 것입니다. 전지 (500 000)의 작은 숫자는 줄기 세포가 빈 틈새 소수의 집에 수있는 위의 confounders없이 조사되지 않은 WT 마우스에 주입 수 있습니다.
W / WV 생쥐는 C - KIT 수용체 기능에 결함 어떠한 preconditioning없이 줄기 세포를 합치다 수 있습니다. 이것은 우리가 방사선으로 인한 혈관 부상 또는 시토킨 릴리스의 부재에있는 줄기 세포의 추적 연구를 할 수 있습니다. 이 생쥐를 이용하여 물류 문제는 그것이 번식 콜로니 크기 문제로 인해받는 역할을 WWv 마우스의 충분한 숫자를 얻기 어렵다는 점이다.
간단히 우리가 표준 추적 프로토콜을 설명하지만, 변화는 실험의 디자인 중 답변하고 결정되어야합니다 질문에 따라 달라집니다를 사용합니다.
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Acknowledgments
이 프로토콜은 테스트 데이빗 스캐든의 연구실에 최적화되었습니다. 기금은 다나 파버 암 연구소 / 매사 추세츠 종합 병원 임상 혈액 및 종양학 원정대 프로그램에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E.
