Summary
Detta protokoll visar hur du utför immunohistokemi på dissekeras Drosophila larv.
Abstract
Den
Protocol
Innan du börjar
- Förbered följande lösningar: PBT (0,1% Triton X100 i 1X PBS), PBTB (0,2% BSA i PBT) och PBTN (2% NGS i PBTB).
- Dissekera Drosophila larver. Se Drosophila Larvernas NMJ Dissection.
Immunohistokemi
- Flytta larverna till ett 1,5 ml rör som innehåller PBT. Tvätta larver två gånger 15 minuter i PBT. Observera: att tvätta, placera 1,5 ml röret på en nutator mixer. Ta bort vätska med pippetor och ersätta den med färsk vätska.
- Ta bort PBT. Tvätta i PBTB två gånger under 30 minuter.
- Ta bort PBTB. Tvätta i PBTN två gånger under 15 minuter.
- Inkubera i primära antikroppen späds i PBTN vid rumstemperatur i 1 timme eller vid 4 º C över natten.
- Skölj två gånger med PBTB. Observera: att skölja lägga lösning och ta bort snabbt.
- Tvätta två gånger under 15 minuter i PBTB.
- Tvätta i PBTN i 30 minuter.
- Inkubera i sekundär antikropp (och konjugerad primära antikroppen om du använder en) utspädd i PBTN.
- Täck med aluminiumfolie och låt inkubera under 1,5 timmar i rumstemperatur.
- Skölj två gånger med PBTB.
- Tvätta två gånger i 15 minuter med PBTB.
- Fortsätt till montering.
Montering
Obs: Montera i glycerol om prover kommer att avbildas direkt. Montera i Förlänga guld om prov kommer att lagras innan imaging (för mer än en vecka) eller om prover skall avbildas flera gånger. Om du vill använda, placera en flaska förlänger i 65 ° C vattenbad i 2-3 minuter. Tag en alikvot av Förläng Guld och hålla på en värme-block vid 45-50 ° C.
- Häll betsad preps i PBT in till ett urglas.
- Sätt lite glycerol på en ren glasskiva för bearbetning.
- Flytta djuren till behandling glida genom att plocka ut dem ur urglas med ett hörn med hjälp av pincett. Säkerställa att de nagelband nedåt.
- Ta bort huvud och svans med en fräsch rakblad om behandling glasplatta. En exacto-kniv med blad # 16 fungerar bra för detta.
- På en annan bild (montage bild), lägg en liten droppe av glycerol / förlänga och sprida den med ren pincett.
- Flytta dissekerade djur till montering bilden av deras kant, noga med att inte invertera dem. Försök att montera dem i rader i samma riktning. Mount 6-8 djur per bild.
- Släpp ett omslag halka på genom att placera en kant i glycerol / förlänga och långsamt släppa det.
- Täta bilden med nagellack. Notera [inte bilden tills lacken är torr. Detta tar normalt tio minuter. För prover som monteras i förlänga guld, låt bilderna torka i minst tre timmar innan tätning eller avbildning.]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunohistokemi (IHC) är avgörande för studier av NMJ biologi, eftersom det möjliggör visualisering av NMJ. Detta sker med hjälp av antikroppar som känner igen den neuronala membran (t.ex. HRP), den presynapse (t.ex. CSP, SYT), och / eller postsynapse (t.ex. DLG). Signalmolekyler, strukturella proteiner, eller nya proteiner av intresse kan också färgas. Sedan kan gener vara muterade eller missexpressed, och IHC kan upptäcka störning av synaptiska struktur och / eller neuronal signalering.
Den NMJ i Drosophila har vunnit stor popularitet sedan början av studier som belyst dess grundläggande struktur och funktion. 1-4 Många av de molekyler som har identifierats i studier av Drosophila NMJ bevaras hos ryggradsdjur. 4 Därför lärde sig insikter genom studier av Drosophila NMJ kan gälla synaptiska biologi i många system. Några möjliga tillämpningar är studier av molekyler som är inblandade i synaptisk utveckling, plasticitet, och neurologisk sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
