Summary
هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ المناعية على يرقة ذبابة الفاكهة تشريح.
Abstract
و
Protocol
قبل أن تبدأ
- إعداد الحلول التالية : PBT (0.1 ٪ X100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1X) ، PBTB (0.2 ٪ في جيش صرب البوسنة PBT) ، وPBTN (خ ع 2 ٪ في PBTB).
- تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات. يرجى الاطلاع على ذبابة الفاكهة تشريح NMJ اليرقات.
المناعية
- نقل اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على PBT. غسل اليرقات مرتين لمدة 15 دقيقة في PBT. ملاحظة : أن يغسل ، ووضع أنبوب مل 1.5 على خلاط nutator. إزالة السائل مع pippetor واستبدالها السائلة الطازجة.
- إزالة PBT. يغسل في PBTB مرتين لمدة 30 دقيقة.
- إزالة PBTB. يغسل في PBTN مرتين لمدة 15 دقيقة.
- في احتضان الضد الأولية مخففة في PBTN في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- شطف مرتين مع PBTB. ملاحظة : حل لشطف إضافة وإزالة بسرعة.
- تغسل مرتين لمدة 15 دقيقة في PBTB.
- يغسل في PBTN لمدة 30 دقيقة.
- في احتضان الضد الثانوية (والضد الأولية مترافق إذا كنت تستخدم واحد) في PBTN المخفف.
- تغطي في البربون واحتضان مقابل 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف مرتين مع PBTB.
- تغسل مرتين لمدة 15 دقيقة مع PBTB.
- الشروع في التركيب.
متزايد
ملاحظة : في جبل الجلسرين إذا كان سيتم تصوير العينات على الفور. جبل الذهب في إطالة ما اذا كان سيتم تخزين العينات قبل التصوير (لأكثر من أسبوع) ، أو إذا كان يجب التقط عينات عدة مرات. للاستخدام ، وضع زجاجة من إطالة في 65 º C حمام الماء لمدة 2-3 دقائق. يأخذ قسامة من الذهب وإطالة البقاء على على كتلة حرارة 45-50 درجة مئوية في
- صب محضرات الملون في PBT إلى كوب ووتش.
- وضع بعض الجلسرين على شريحة زجاجية نظيفة للمعالجة.
- نقل الحيوانات إلى شريحة المعالجة من قبل انتشالها من الزجاج ووتش زاوية باستخدام ملقط. ضمان أن تكون بشرة الجانب الأسفل.
- إزالة الرأس والذيل مع شفرة حلاقة جديدة على معالجة شريحة زجاجية. وexacto سكين مع شفرة # 16 يعمل بشكل جيد لهذا الغرض.
- على شريحة أخرى (تركيب الشريحة) ، وضع قطرة صغيرة من الجلسرين / إطالة وانتشاره مع ملقط نظيفة.
- تشريح الحيوانات نقل إلى الشريحة المتزايدة التي ميزتها ، مع الحرص على عدم قلب لهم. محاولة تحميل لهم في الصفوف في اتجاه واحد. جبل 6-8 الحيوانات لكل شريحة.
- انخفاض زلة تغطية على حافة طريق وضع في الجلسرين / إطالة والإفراج عن ببطء.
- ختم الشريحة مع طلاء الأظافر. علما [لا صورة حتى طلاء الأظافر جافة. هذا عادة ما يستغرق عشر دقائق. للعينات التي شنت في إطالة الذهب ، والسماح للشرائح الجافة لثلاث ساعات على الأقل قبل الختم أو التصوير.]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المناعية (IHC) أمر حيوي لدراسة البيولوجيا NMJ لأنه يمكن تصور من NMJ. ويتم إنجاز هذا باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف غشاء الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، HRP) ، وpresynapse (على سبيل المثال ، CSP ، SYT) ، و / أو postsynapse (على سبيل المثال ، DLG). ويمكن أيضا الإشارة الجزيئات والبروتينات الهيكلية ، أو البروتينات الرواية تكون المصلحة الملون. ثم ، يمكن أن تحور الجينات أو missexpressed ، ويمكن الكشف عن اضطراب IHC هيكل متشابك و / أو الإشارات العصبية.
علم الرؤى وNMJ من ذبابة الفاكهة قد اكتسب شعبية كبيرة منذ أوائل الدراسات التي مضيئة هيكلها الأساسي ووظيفتها. 1-4 والحفظ وكثير من الجزيئات التي تم تحديدها في دراسة NMJ ذبابة الفاكهة في الفقاريات. 4 لذلك ، من خلال دراسات قد لذبابة الفاكهة NMJ أن تنطبق على البيولوجيا متشابك في كثير من النظم. بعض التطبيقات الممكنة تشمل دراسة الجزيئات العاملة في مجال التنمية متشابك ، اللدونة والأمراض العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
