Summary
इस प्रोटोकॉल को दर्शाता है कैसे dissected ड्रोसोफिला लार्वा पर immunohistochemistry प्रदर्शन करने के लिए.
Abstract
Protocol
इससे पहले कि आप शुरू
- निम्न समाधानों को तैयार: पीबीटी (1X पीबीएस में 0.1% ट्राइटन X100), (0.2% पीबीटी में BSA), PBTB और PBTN (PBTB में 2% NGS).
- ड्रोसोफिला लार्वा काटना. ड्रोसोफिला लारवल NMJ विच्छेदन कृपया देखें.
Immunohistochemistry
- लार्वा एक 1.5 मिलीलीटर पीबीटी युक्त ट्यूब हटो. लार्वा पीबीटी में 15 मिनट के लिए दो बार धो. नोट: धो, एक nutator मिक्सर पर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब जगह. Pippetor साथ तरल निकालें और यह ताजा तरल के साथ की जगह.
- पीबीटी निकालें. PBTB में दो बार 30 मिनट के लिए धो.
- PBTB निकालें. PBTN में दो बार 15 मिनट के लिए धो.
- कमरे Temp पर PBTN में 1 घंटे के लिए या 4 º रातोंरात सी पतला प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते हैं.
- PBTB के साथ दो बार कुल्ला. नोट: जोड़ने के समाधान कुल्ला और जल्दी से हटायें.
- PBTB में 15 मिनट के लिए दो बार धोएं.
- 30 मिनट के लिए PBTN में धो डालें.
- PBTN में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी (और संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी अगर आप एक का उपयोग कर रहे हैं) में सेते हैं.
- टिनफ़ोइल और सेते में कमरे के तापमान में 1.5 घंटे के लिए कवर.
- PBTB के साथ दो बार कुल्ला.
- PBTB के साथ 15 मिनट के लिए दो बार धोएं.
- बढ़ते करने के लिए आगे बढ़ें.
बढ़ते
नोट: ग्लिसरॉल में माउंट अगर नमूने तुरंत imaged किया जाएगा. गोल्ड लम्बा माउंट अगर इमेजिंग पहले नमूने संग्रहीत किया जाएगा (एक सप्ताह से अधिक के लिए) या यदि नमूने कई बार imaged किया जाना चाहिए. का उपयोग करने के लिए, 2-3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लम्बा की एक बोतल जगह है. लम्बा गोल्ड के एक विभाज्य ले लो और एक गर्मी ब्लॉक में 45-50 º सी. पर रखना
- एक घड़ी का शीशा पीबीटी में दाग preps डालो.
- प्रसंस्करण के लिए एक साफ कांच की स्लाइड पर कुछ ग्लिसरॉल रखो.
- प्रसंस्करण स्लाइड पर उन्हें उठा बाहर एक कोने का उपयोग संदंश द्वारा घड़ी का शीशा के द्वारा पशुओं को ले जाएँ. वे छल्ली नीचे की ओर कर रहे हैं सुनिश्चित करें.
- सिर और प्रसंस्करण गिलास स्लाइड पर एक ताजा धार के साथ पूंछ निकालें. # 16 ब्लेड के साथ एक exacto चाकू से इस के लिए अच्छी तरह से काम करता है.
- अन्य स्लाइड पर (स्लाइड बढ़ते), ग्लिसरॉल के एक छोटे से ड्रॉप डाल / लम्बा और यह साफ संदंश के साथ फैल.
- अपनी धार से बढ़ते स्लाइड के लिए dissected जानवरों हटो, ध्यान लेने के लिए उन्हें नहीं पलटना. उन्हें एक ही ओरिएंटेशन में पंक्तियों में माउंट करने की कोशिश करो. स्लाइड प्रति 6-8 जानवरों माउंट.
- ग्लिसरॉल में एक बढ़त / रखकर लम्बा और धीरे धीरे इसे जारी द्वारा कवर पर पर्ची गिरा.
- नाखून वार्निश के साथ स्लाइड सील. नोट [छवि मत करो जब तक वार्निश सूखा है. यह आमतौर पर दस मिनट लगते हैं. लम्बा सोने में रखा नमूने के लिए, कम से कम तीन घंटे के लिए सील या इमेजिंग पहले स्लाइड्स सूखी.]
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Discussion
Immunohistochemistry (आईएचसी) NMJ जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह NMJ के दृश्य सक्षम बनाता है. इस एंटीबॉडी कि neuronal झिल्ली (जैसे, एचआरपी), (उदाहरण के लिए, CSP, SYT) presynapse, और / या (जैसे, DLG) postsynapse पहचान का उपयोग करके पूरा किया है. संकेतन अणुओं, संरचनात्मक प्रोटीन, या हित के उपन्यास प्रोटीन भी दाग जा सकता है. फिर, जीन या उत्परिवर्तित किया जा सकता है missexpressed, और आईएचसी synaptic संरचना और / या neuronal संकेत की गड़बड़ी का पता लगा सकते हैं.
ड्रोसोफिला के NMJ प्रारंभिक अध्ययन है कि अपनी बुनियादी संरचना और समारोह के प्रबुद्ध के बाद से महान लोकप्रियता प्राप्त की है 1-4 अणुओं है कि ड्रोसोफिला NMJ के अध्ययन में पहचान की गई है के कई रीढ़ में संरक्षित कर रहे हैं. 4 इसलिए, अंतर्दृष्टि अध्ययन के माध्यम से सीखा है ड्रोसोफिला NMJ के कई प्रणालियों में synaptic जीव विज्ञान के लिए लागू किया जा सकता है. कुछ संभव अनुप्रयोगों synaptic विकास, plasticity, और स्नायविक रोग में शामिल अणुओं का अध्ययन शामिल है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope “Stemi” 2000 | Carl Zeiss, Inc. | 495101-9804-000 | |
| Light Source KL 1500 LCD | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1063-181 | |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Adams™ Nutator Mixer | BD Biosciences | 421105 | |
| No.1 Precision knife | X-Acto | 3201 | |
| No. 16 Blades | X-Acto | 216 | |
| ProLong Gold Antifade reagent | Invitrogen | 36930 |
References
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
- Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
- Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
