Summary
هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.
Abstract
واحدة من مزايا دراسة الزرد هو سهولة وسرعة معالجة مستويات البروتين في الجنين. يمكن إضافة Morpholinos ، والتي هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية مع التكامل العقاقير لالرناوات المستهدفة ، إلى جنين للحد من التعبير عن الجينات منتج معين. على العكس ، يمكن إضافة إلى معالجة مرنا الجنين لزيادة مستويات منتج الجين. السيارة إما لإضافة أو مرنا morpholino إلى الجنين microinjection. Microinjection غير فعالة وسريعة ، مما يسمح للحقن مئات من الأجنة في الساعة. هذا الفيديو يبين كل الخطوات التي تنطوي عليها microinjection. باختصار ، يتم جمع البيض على الفور بعد أن وضعت واصطف ضد شريحة المجهر في طبق بتري. المقبل ، ويرتبط إبرة رفيعة ذات الرؤوس محملة مواد الحقن لmicroinjector ومصدر الهواء ، ويتم ضبط الضوابط microinjector لإنتاج وحدة حقن مرغوب فيه. وأخيرا ، انخفضت الإبرة في صفار الجنين ويطرد morpholino أو مرنا.
Protocol
الجزء 1 : إنتاج البيض ، وجمع
- ليلة قبل الحقن ، التي أنشئت في تربية الأسماك مع فواصل الدبابات في المكان. لزيادة إجمالي إنتاج البيض ، ويمكن تعيين ما يصل السمك في نسبة اثنين إلى واحد من الذكور الإناث إذا رغبت في ذلك.
- في صباح اليوم التالي ، وبعد تشغيل أضواء الغرفة ، سحب فواصل من عدة دبابات والسماح لحوالي 20 دقيقة من وقت التزاوج دون عائق.
- باستخدام مصفاة ، وجمع البيض من أقفاص التربية وشطف لهم المياه البيض. صب البيض في صحن بيتري البيض مع الماء وإزالة الأنقاض وبويضة غير مخصبة مع ماصة نقل. ويمكن تجميع الأسماك في خزانات أكبر لانتاج قذائف إضافية من البيض للحقن. ضبط توقيت جمع البيض للسماح للأرقام الحد الأقصى من البيض إلى أن يتم إنتاجها من دون السماح لهم بالمرور المرحلة خلية واحدة.
- مكان شريحة المجهر في غطاء المقلوب طبق بيتري 100mm. استخدام ماصة نقل إلى خط يصل البيض ضد الجانب من الشريحة التي تشكل عمود واحد. إزالة المياه الزائدة من البيض الشريحة بالضغط على Kimwipe ضد الجانب الآخر البيض. (الشكل 1A)
الجزء 2 : سحب إبرة ، التحميل ، وإعداد
- مع مجتذب micropipette ، سحب الزجاج OD 1.0mm الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150mm عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مقدما.
- Backload الإبرة مع 3 ميكرولتر من مواد الحقن باستخدام ماصة microloader. يهز بلعة نحو غيض الإبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية.
- بدوره على مصدر الهواء وmicroinjector. ادخال الإبرة في microinjector وضمان ختم ضيقة داخل السكن. تأكد من أن micromanipulator في موقف مناسب للسماح لمجموعة واسعة من الحركة والتكيف. جلب رأس الإبرة في الطائرة من عرض من المجهر ، وارتفاع قبالة المرحلة ، والتركيز على أنحف منطقة الحافة. استخدام زوج من الملقط حادة لقرصة قبالة الإبرة في النقطة التي يترك إبرة ضيقة بما يكفي لاختراق المشيماء وصفار البيض ولكن لا تزال قادرة على إيصال حجم حبة متسقة. ويمكن استخدام قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر لحساب حجم كل حقنة. عندما يحقن في النفط ، مع حبة قطره 0.1 ملم تحتوي على 500 من المواد PL الحقن (1B الشكل) ، وتستخدم عادة حقن كميات من 500 أو PL 1nL. كساد على دواسة القدم ورصد حجم حبة في حين خفضت الإبرة وضبط ضغط الحقن حسب الحاجة. وحقن كميات مثالية ملء ما يقرب من 10 ٪ من حجم البيضة. نوعية رأس إبرة أمر حاسم لتخفيف كل من الحقن والجودة والاتساق في النتائج.
الجزء 3 : حقن
- ضمان أجنة لم تتطور في المرحلة الماضية أربعة الخلية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون الأجنة في مرحلة واحدة الخلية.
- انخفاض الإبرة في اتجاه العمود من البيض ، وعقد الطبق في مكان مع يدك المعاكس.
- يخترق سطح المشيماء وأدخل صفار بضربة واحدة على نحو سلس في حين يراقب عن أي تكسير أو تمزق في كيس المح. حقن مواد الحقن في صفار (الشكل 1C). تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن أو تمتد صفار إما أن تكون قاتلة للجنين. تعمل باستمرار على الخط ، وضبط الضغط حسب الحاجة للحفاظ على حجم حبة ومتسقة ، وذلك باستخدام ماصة الحافة ، إزالة البيض التي تبدو غير مخصبة أو دمرت خلال عملية الحقن.
- بعد الانتهاء من عمود من البيض ، واستخدام تيار من الماء البيض لطيف لنقل البيض حقنها طبق بيتري نظيفة. كرر حسب الضرورة. تبقي عدة أجنة uninjected كمجموعة تحكم. في نهاية يوم واحد ، وإزالة أجنة ميتة وسجل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء في طبق البيض دوريا لتقليل فرصة الإصابة.
الجزء 4 : نتائج الممثل
اعتمادا على ما يجري حقن ، قد الأجنة البقاء بسعر أقل من إخوانهم uninjected. لحسن الحظ ، فإنه من السهل على ضخ كميات هائلة منه ، لذلك هذا نادرا ما يمثل مشكلة. فمن الطبيعي أن تظهر لmorphants التنمية تأخر قليلا.
لتوضيح نتائج microinjection ، استخدمنا هذا البروتوكول لمعالجة مستويات البروتين القلب من الزجاج (حج). حج هو بروتين عبر الغشاء اللازمة للتنمية القلب العادي. في غيابها ، مع قلوب الأجنة تطوير مساحات تدفق العملاقة والغرف 1. حقن نحن اثنان morpholinos لم يسبق وصفه ضد حج ، وheg_e3i3_egfr1 heg_e4i4_egfr2 ، عند تركيز 500 ميكرومتر. في آخر أيام 2 الإخصاب ، والضوابط الأخوة uninjected تبدو طبيعية ، كما هو متوقع (2A الرقم وباء). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ (الشكل 2C). على الرغم من أن قلوب معظم هذه morphants غيرت التشكل ، والغرف الخاصة بهم الحجم عادة (الشكل 2D). حقن الأجنةبعيوب المعرض heg_e4i4_egfr2 القلب متغير. بعض تبدو طبيعية ، في حين أن البعض الآخر تدفق مساحات كبيرة ومتوسطة الأذينين الموسع (2E الرقم وF). ومتحولة حج ، كما ذكرت سابقا 1 ، لديها الجهاز بشكل كبير وتوسيع تدفق الأذين (الشكل 2G و H).
نحن أيضا حقن الأجنة wildtype مرنا مع 400 نانوغرام / ميكرولتر مستنسخة من كامل طول حج [كدنا]. بينما تسيطر uninjected تتطور بشكل طبيعي (الشكل 3A وباء) والأجنة حقنوا حج مرنا المعرض تشكيلة واسعة من الظواهر تتراوح ما بين ظهور wildtype لتصقلب شديد ، وتقصير من محور الجسم الرئيسي ، تنخر في الرأس والجسم ، وعيوب خط الوسط (الشكل 3C ودال).
تصطف الشكل 1. الأجنة ليتم حقنه ضد شريحة المجهر في طبق بيتري (A). ويتحدد حجم الحقن عن طريق حقن في الزيوت المعدنية وضعت على ميكرون. وحدة تخزين حقن 500 رر ، التي يشيع استخدامها ، التي يبلغ قطرها 0.1 ملم (B). فورا بعد الحقن ، وmorpholino مرنا أو مرئيا كبقعة تلم في صفار (C).
الشكل 2. وفي آخر أيام 2 الإخصاب والأجنة uninjected ليس لديهم عيوب جسيمة (A) أو النمط الظاهري القلب (B). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 morpholino وذمة الدماغ (C ، السهم) ولكن عادة حجرات القلب الحجم (D). بعض الأجنة حقنوا heg_e4i4_egfr2 morpholino ومساحات تدفق الموسع والأذينين (E ، F). حج والمسوخ مساحات تدفق الموسع بشدة والأذينين (G ، H). (أ) و (C) ، (E) ، و (G) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) ، (D) ، (F) و (ه) هي الصور 20X مدينة دبي للإنترنت. ردهة = ، فإنه = تدفق المسالك.
الشكل 3. وفي 24 التسميد آخر ساعة ، uninjected اجنة لديها طويل ، مستقيم الجسم مع عدم وجود عيوب أو نخر خط الوسط (أ) و عينان محددة بوضوح مع الأنبوب العصبي بينهما (B). بعض الأجنة حقنوا مرنا حج ، في المقابل ، يحمل محور الجسم تقصير ، نخر ، somites شوه (C) ، وتصقلب (D). (أ) و (ج) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) و (D) والصور 20X مدينة دبي للإنترنت.
Discussion
واحدة من نقاط القوة في النظام النموذجي الزرد هو السهولة التي يمكن أن تضاف إلى المنتجات جين معين أو التخلص من الجنين قبل microinjection. لoverexpress بتواجد مطلق بروتين خاص ، ترميز مرنا يحقن في صفار في المرحلة 1 - الخلية. خلال نمو الجنين في وقت لاحق ، يتم توزيع الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء الحي وترجمتها. على العكس ، من أجل القضاء على بروتين خاص ، تستخدم morpholinos. Morpholinos هي [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية المصممة التكامل مع العقاقير لالرناوات محددة. مثل mRNAs ، يتم حقن morpholinos في صفار في المرحلة 1 - الخلية. داخل الجنين أنها تربط الرناوات هدفهم ، ومنع الترجمة.
التعديل الرئيسي الذي يحتاج الى بذل كل morpholino مرنا أو هو تركيز المادة المحقونة. قد عالية للغاية من تركيز إما morpholino مرنا أو غير محددة تسبب التسمم ، في حين يجب أن يتم اختبار كل morpholino تجريبيا لتحديد تركيز على النحو الأمثل ، وعادة تركيزات morpholino بين 200 ميكرومتر و500 ميكرومتر نهدم نشاط الجينات على نحو فعال دون أن تسبب تشوهات غير محددة. الحجم الدقيق لفتح إبرة ليست حاسمة. ويمكن ضمن مجموعة من الأحجام الإبرة ، وضغط الحقن والحقن يمكن ضبط الوقت لانتاج بلعة من حجم الصحيح.
Morpholinos لها تطبيقات عديدة ، بما في ذلك تشريح وظيفي من المجالات داخل البروتين. عندما صمم لهدف محدد ، اكسون إنترون التقاطعات ، وسوف morpholinos منع الربط من حدوث هناك. درسنا آثار اثنين من morpholinos التي تربط بين اكسون - إنترون تقاطعات مرنا في حج من قبل. وheg_e3i3_egfr1 morpholino يربط بين مفترق اكسون 3 و 3 إنترون ، ومنع من الربط آلات دمج اكسون 3 في النصوص الناضجة. وبالمثل heg_e4i4_egfr2 morpholino يزيل اكسون 4. كلا exons متماثلة 3 و 4 التي تحتوي على ترميز EGF المجالات مثل تكرار. بعض الأجنة حقنوا نسخة مظهرية معتدلة heg_e4i4_egfr2 ومتحولة ، وسوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من التجارب على فهم دور حج اكسون 4 في التنمية القلب. من المدهش ، مع حقن الأجنة heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ ، وهي ميزة لا ينظر في حج المسوخ. هذا قد يكون راجعا إلى قدرة morpholinos ربط النصوص الأم التي لن تتأثر في لاقحي المسوخ.
Acknowledgments
نعترف أعضاء المختبر Mably وStorer Narie للحصول على المساعدة التقنية ، وجمعية القلب الأمريكية (NCRP ساينتست التنمية 0635363N غرانت) والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم المعهد (المنحة SCCOR RFA HL02 - 027) للحصول على التمويل
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | MN 153 | |
| Needle Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P 97 | |
| Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100 F6 | |
| Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Needle Holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH310 |
References
- Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).
