Monitoraggio ormoni vegetali Durante risposte allo stress

Summary

Un metodo semplice è previsto che consente l'estrazione rapida e analisi di ormoni vegetali più da piccoli campioni di tessuto. La procedura di estrazione utilizza vapore fase come la fase di purificazione solenne. I campioni vengono analizzati mediante GC / MS con ionizzazione chimica che produce principalmente (M +1) + ioni.

Abstract

Ormoni vegetali e composti correlati segnalazione svolgono un ruolo importante nella regolazione delle risposte delle piante ai vari stimoli ambientali e sottolinea. Tra le sollecitazioni più severe sono insetti erbivori, infezioni degli agenti patogeni e stress da siccità. Per ognuna di queste sollecitazioni uno specifico insieme di ormoni e / o loro combinazioni sono noti per mettere a punto le risposte, garantendo così la sopravvivenza della pianta. I principali ormoni coinvolti nella regolazione di queste risposte sono l'acido jasmonic (JA), acido salicilico (SA), e l'acido abscissico (ABA). Per meglio comprendere il ruolo degli ormoni individuali e la loro potenziale interazione durante queste risposte è necessario monitorare i cambiamenti nella loro abbondanza in un temporale e in un modo spaziale. Per la quantificazione semplice, sensibile e riproducibile di questi e di altri composti segnalazione abbiamo sviluppato un metodo basato sulla estrazione in fase vapore e gas cromatografia / spettrometria di massa (GC / MS) analisi (1, 2, 3, 4). Dopo l'estrazione di questi composti dal tessuto vegetale da acquosi acidi 1-propanolo mescolato con il diclorometano carbossilico contenenti composti sono metilate, volatilizzato a caldo, e raccolto su un assorbente polimerici. Dopo l'eluizione in una fiala campione gli analiti siano separati mediante gascromatografia e spettrometria di massa rilevati da ionizzazione chimica. L'uso di appropriati standard interno consente poi, per la quantificazione semplice mettendo in relazione le aree del picco dello standard dell'analita ed interna.

Protocol

1. Per prima cosa dobbiamo preparare il 2 ml con tappo a vite fiale per l'estrazione: Aggiungi 400ul tampone di estrazione (1-propanolo: H2O: HCl concentrato 2:1:0.002 vol / vol / vol) e 10 ml di standard rispettivi interno (10ng/μl ) in una sacca. Congelare in azoto liquido e quindi aggiungere le perline in ceramica.
2. Aggiungere il materiale vegetale (tra 50 e 200 mg), mentre le fiale sono ancora posizionati nel azoto liquido. Si noti che il peso del materiale vegetale aggiunto deve essere valutato prima di proseguire per consentire in seguito per la quantificazione esatta, che si basa sul peso fresco.
3. Assicurarsi che tutti l'azoto liquido è evaporato prima a chiusura ermetica la fiala con un tappo. Si noti che il tappo deve avere una guarnizione di gomma per evitare fuoriuscite di solventi e quindi, composti estratti durante l'omogeneizzazione.
4. Omogeneizzare il tessuto in una FastPrep o Precellys omogeneizzatore smerigliatrice tallone ad una velocità di 6000 (per Precellys) per 30 sec.
5. Rimuovere fiale da omogeneizzatore singolarmente, aprire con cautela il tappo e aggiungere 1 ml di diclorometano per ogni campione. Fiale richiudere saldamente e omogeneizzare di nuovo per 10-15sec a 6000 (Precellys).
6. Trasferimento fiale per una centrifuga da tavolo e separare la fase organica dalla fase acquosa 10.000xg per 60sec.
7. Dopo separazione delle fasi trasferire lo strato inferiore verde (fase organica, contiene gli ormoni e gli standard interni) fiale da individuo a una fiala di vetro pulito 4ml. Evitare il trasferimento di acqua (fase superiore). In alternativa, acetato di etile può essere usato al posto di diclorometano. In questo caso la fase ethyacetate sarà lo strato superiore (verde) e ora è più facile da rimuovere e trasferito in una fiala di vetro fresco 4ml. Come prima, evitare il trasferimento di acqua.
8. Soffiare via il solvente con l'aria attraverso un collettore per circa 10-25 minuti (dipende dal campione); controllare con una punta del flusso d'aria solo se i campioni sono a secco (con attenzione). Non asciugare eccessivamente campioni, per questo potrebbe causare perdite di composti.
9. Una volta che i campioni sono asciugati possiamo iniziare la metilazione del carbossilico composti contenenti nei nostri campioni. In primo luogo, 100 l di una diethyether / miscela di metanolo (9:1 vol / vol) vengono aggiunti a ogni flacone seguita da 4μl di una soluzione trimethylsilyldiazomethane 2M (in esano, Sigma Aldrich). I flaconi sono immediatamente chiuso con un open-top tappo a vite dotato di un setto in Teflon rivestito di silicone. Agitare delicatamente ed incubare a RT per 25 a 30 min.
10. Dopo aver terminato il punto 9, girare su un blocco di riscaldamento e alla temperatura impostata collezione desiderata. La volatilità dei composti metilati dipende dalle loro dimensioni, ma anche su altri gruppi, come più polare = O,-OH, e-NH. Per l'acido salicilico e jasmonic esteri metilici degli acidi una temperatura collezione di circa 80 ° C sono sufficienti, mentre per esempio altri composti come acidi grassi C18, jasmonic acido-amino acido coniugati, coronatine, e 12-oxo-phytodienoic estere metilico dell'acido richiedono di temperatura tra 180-200 ° C per volatilizzare in modo efficace.
11. Dopo una incubazione di 30 minuti la reazione di metilazione deve essere fermata per evitare indesiderate reazione secondaria. Questo viene fatto aggiungendo 4 ml di acido acetico 2M uno-soluzione (in esano) per ogni flacone. Dopo aver chiuso le fiale con tappi e un vortex breve, i campioni sono autorizzati a incubare per altri 30 min.
12. I filtri utilizzati per questa estrazione in fase vapore sono fatti a mano e nella forma presentata non disponibili in commercio. Sono composti da un tubo esterno in teflon (circa 7-8 centimetri di lunghezza), in cui da un lato si inserisce un ben raccordo tubo di vetro di circa 4 centimetri di lunghezza. Dall'altra parte del tubo in Teflon uno maglia di acciaio inossidabile disco viene spinto all'interno del tubo fino a raggiungere la camera d'aria di vetro e su che circa 20-30mg di adsorbenti (sia SuperQ 80/100 (fuori produzione) o HayeSep ® Q80/100) sono aggiunti. Un altro disco in acciaio inox viene inserito in rete e infine una punta di vetro si spinge nel tubo in Teflon, così accuratamente premendo il disco di rete d'acciaio inox sul assorbente. Un quadro dettagliato di un filtro è mostrato in figura 1.
    
    Figura 1.
13. Durante il periodo di incubazione del punto 11, i filtri per la raccolta del metilato e quindi, ormoni vegetali volatili, devono essere lavati con 200ul prima di metanolo, e poi 2 lavaggi con diclorometano 200ul ciascuno. Solvente rimanente nei filtri è poi saltato fuori per via aerea. I filtri possono ora essere utilizzati per la cattura di ormoni volatili attraverso l'estrazione in fase vapore.
14. Dopo 30 min di incubazione i setti di gomma della fiala 4ml tappi vengono tagliati con un bisturi. Per raccogliere gli ormoni vegetali per estrazione fase vapore sono collegati i filtri puliti per linee di vuoto individuo ad un flusso di circa 800ml/min. I filtri vengono poi inseriti nel flaconcino attraverso i setti taglio. Un consiglio pipetta piccolo è anche inserito di agire come una presa d'aria. Durante questa parte iniziale della procedura le fiale con i filtri inseriti devono essere tenutein posizione verticale per evitare di liquido all'interno della fiala di entrare in contatto con la punta filtro, che potrebbe contaminare il filtro e successivamente anche il GC / MS. Le fiale sono poi tenuti a mano fino a quando tutto il liquido è evaporato attraverso il filtro. Poi le fiale con i filtri attaccati sono immessi sul blocco di riscaldamento e calore evaporato composti raccolti per 3min. I componenti principali del sistema e la configurazione sono rappresentati in figura 1. Dopo questo ultimo passaggio di estrazione in fase vapore le fiale con i filtri ancora attaccato sono posti su una griglia e lasciate raffreddare.
15. Quando i filtri hanno raggiunto la temperatura ambiente nuovo sono eluiti con 150 ml di diclorometano in un 1,5 ml GC-flacone dotato di un inserto. Alter soffia il solvente residuo dal filtro sono ricoperti i flaconi e analizzati mediante GC / MS.

Un gascromatografo dotato di un iniettore split / splitless (splitless modalità 250 ° C, volume di iniezione 1μ) interfacciato ad uno spettrometro di massa operante a ionizzazione chimica (CI) deve essere utilizzato per l'analisi). I composti sono separati nei sistemi HP-1MS colonna (30m x 0,25 millimetri x 025μm) ha tenuto a 40 ° C per 1 minuto dopo l'iniezione, e poi la temperatura programmata a 15 ° C / min a 250 ° C (per 10 minuti), con elio come il vettore gas (0.7ml/min flusso costante). Per gli Stati membri a base di analisi di entrambi, un quadropole (ad es Agilent HP5973) e uno ione trappola-based (ad esempio, Varian Saturn 2200) spettrometro di massa può essere utilizzato. Come gas CI sia isobutano (viene in serbatoi di gas) o metanolo (vapori da un serbatoio di liquido vengono utilizzate) si possono utilizzare, comunque, in ogni caso i frammenti della reazione di ionizzazione deve essere verificata prima che il numero di ioni selezionati (SIC) programmi sono state create. Abbiamo usato il seguente programma per un sistema GC Varian 3900/Saturn MS 2200 e il metanolo come reagente CI: 5.00-11.30min ioni (M +1) ⁺ 153-158 (metil salicilato 153, metil ² H _{5-salicilato);} 11.30-13.30min ioni (M +1) ⁺ 207-228 (metil jasmonate 207 e 225, metil dihydrojasmonate 209 e 227); 13.30-16.30min ioni (M +1) ⁺ 237-300 (metil acido abscissico 261, metil ² H _6-acido abscissico 267 (acido abscissico produce prevalentemente [MH ₂ O +1] ⁺ ioni). Tutti i composti devono essere individuate tramite il confronto con autentici standard disponibili in commercio. Quantificazione dei JA, SA, e ABA è fatto, correlando l'area del picco (estratto ioni) con l'area del picco (ioni estratta) dello standard rispettivi ordinamenti ed è anche in base al peso fresco del materiale vegetale utilizzato.

Discussion

Il metodo presentato qui ha dimostrato di funzionare in modo affidabile per una vasta gamma di composti vegetali segnalazione a condizione che la dimensione e la natura chimica del composto non gli impediscono di essere estratta, metilato, e vaporizzato. Inoltre, la procedura di metilazione in quanto è qui descritto non è l'unico modo di derivatizzazione. Silyllation e acetilazione sono metodi alternativi e protocolli possono essere trovati facilmente on-line.

Se lo spettrometro di massa non è in grado di singolo ione di monitoraggio della gamma di massa che viene registrato durante una corsa dovrebbe essere limitata a escludere un numero eccessivo di ioni indesiderati dal processo. Per esempio, l'acido jasmonic (JA) e il suo standard interno acido diidro jasmonic (dhJA) producono due grandi (M +1) ⁺ ioni, 207 e 225 per JA, e 209 e 227 per dhJA durante la ionizzazione chimica con il metanolo. Perché questi due grandi (M +1) ⁺ masse (207 e 225 per JA, 209 e 227 per dhJA) non hanno la stessa abbondanza rationfor JA e dhJA, entrambi dovrebbero essere estratti e utilizzati per la quantificazione. Pertanto, un intervallo di massa 207-228 dovrebbero essere registrati e gli ioni specifici devono essere estratti più tardi.