Summary
השיטה הפשוטה היא ובלבד מאפשר מיצוי ניתוח מהיר של הורמונים צמחיים מרובים דגימות רקמה קטנות. הליך משתמשת מיצוי שלב אדי כצעד טיהור חגיגית. דוגמאות מנותחות על ידי GC / MS עם יינון כימי שמייצר בעיקר (M 1) יונים +.
Abstract
הורמוני הצמח תרכובות איתות הקשורים לשחק תפקיד חשוב בוויסות של תגובות צמחים לגירויים סביבתיים ומדגיש שונים. בין מדגיש חמורים ביותר הם herbivory חרקים, זיהום הפתוגן, ומתח הבצורת. עבור כל אחד מהם מדגיש קבוצה מסוימת של הורמונים ו / או צירופם של אלה ידועים לכוונן את התגובות, ובכך להבטיח הישרדות של הצמח. ההורמונים העיקריים המעורבים בוויסות של תגובות אלה חומצה jasmonic (JA), חומצה סליצילית (SA), וחומצה abscisic (ABA). כדי להבין טוב יותר את התפקיד של הורמונים הפרט, כמו גם אינטראקציה הפוטנציאל שלהם במהלך התגובות הללו יש צורך לעקוב אחר השינויים השפע שלהם הזמני כמו גם בצורה מרחבית. עבור כימות קל, רגיש, לשעתקו אלה ותרכובות אחרות איתות פיתחנו שיטה המבוססת על מיצוי שלב אדי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה גז (GC / MS) ניתוח (1, 2, 3, 4). לאחר חילוץ התרכובות הללו מרקמות הצמח על ידי מימית חומצית 1-propanol מעורבב עם dichloromethane חומצה המכילים תרכובות carboxylic הם מפוגל, מתאיידים תחת חום, שנאספו על סופג פולימריות. לאחר elution לתוך בקבוקון מדגם analytes מופרדים על ידי גז כרומטוגרפיה ו זוהה על ידי ספקטרומטריית יינון כימי המוני. השימוש בסטנדרטים הפנימי המתאים ואז מאפשרת כימות פשוט על ידי הנוגעים בתחומים השיא של תקן אנליטי ופנימיים.
Protocol
- ראשית אנחנו צריכים להכין את 2ml בורג מכסה צלוחיות להפקת: הוסף חוצץ מיצוי 400ul (1-propanol: H2O: מרוכזת HCl 2:1:0.002 כרך / כרך / כרך א) ו - 10 μl של התקן פנימי, בהתאמה (10ng/μl ) כדי בקבוקון. הקפאה בחנקן נוזלי ולאחר מכן להוסיף את חרוזי קרמיקה.
- מוסיפים את חומר צמחי (בין 50 ל 200 מ"ג), בעוד צלוחיות מוצבים עדיין חנקן נוזלי. שים לב כי המשקל של החומר צמח הוסיף צריך להיות מוערך לפני עיבוד נוסף כדי לאפשר מאוחר יותר כימות מדויק, אשר מבוססת על משקל טרי.
- ודא שכל החנקן הנוזלי מתאדה עוד לפני סגירת בחוזקה את הבקבוקון עם כובע. שים לב, כובע צריך להיות חותמת גומי כדי למנוע נזילות של ממיסים ולכן, תרכובות שחולצו במהלך homogenization.
- Homogenize רקמות FastPrep או Precellys homogenizer חרוז מטחנת במהירות של 6000 (עבור Precellys) למשך 30 שניות.
- הסר צלוחיות מ homogenizer בנפרד, לפתוח בזהירות את המכסה ומוסיפים 1ml של dichloromethane לטעום כל אחד. צלוחיות סגור שוב בחוזקה homogenize שוב 10-15sec ב 6000 (Precellys).
- העברת צלוחיות על השולחן צנטריפוגה ולהפריד את השלב האורגני משלב מימית ב 10.000xg עבור 60sec.
- לאחר הפרדת פאזות להעביר את השכבה התחתונה ירוק (שלב אורגנית, מכילה את ההורמונים ואת הסטנדרטים הפנימיים) של בקבוקונים בודדים בקבוקון זכוכית נקי 4ml. הימנע העברת מים (השלב העליון). לחלופין, אתיל אצטט יכול לשמש במקום dichloromethane. במקרה זה השלב ethyacetate תהיה השכבה העליונה (ירוק), והוא כעת קל יותר להסיר והועברו בקבוקון זכוכית טרי 4ml. כמו בעבר, למנוע את העברת מים.
- פוצץ את הממס עם האוויר דרך סעפת בערך 10-25 דקות (תלוי מדגם); לבדוק עם טיפ זרימת האוויר יחיד אם דגימות יבשים (בזהירות). אל דגימות overdry, עבור זה עלול לגרום להפסדים של תרכובות.
- לאחר הדגימות מיובש אנחנו יכולים להתחיל את מתילציה של carboxylic חומצה המכילים תרכובות בדגימות שלנו. ראשית, 100 μl של תערובת diethyether / מתנול (09:01 כרך / כרך) מתווספים בקבוקון אחד ואחריו 4μl פתרון trimethylsilyldiazomethane 2M (ב הקסאן, Sigma Aldrich). בקבוקונים סגורים מיד עם מכסה גג פתוח בורג מצויד מחצה טפלון מצופה סיליקון. לנער בעדינות לדגור על RT במשך 25 עד 30 דקות.
- לאחר שסיים את שלב 9, להפעיל בלוק חימום בטמפרטורה להגדיר את האוסף הרצוי. התנודתיות של תרכובות מפוגל תלוי בגודל שלהם, אלא גם על קבוצות אחרות קוטבי יותר כמו = O,-OH, ו-NH. עבור חומצה סליצילית jasmonic ו חומצה מתיל אסטרים אוסף של טמפרטורות סביב 80 מעלות צלזיוס מספיקים, בעוד למשל תרכובות אחרות כמו חומצות שומן C18, jasmonic חומצה אמינית conjugates חומצה, coronatine, ו-12-אוקסו phytodienoic מתיל אסטר חומצה דורשים טמפרטורה בין 180-200 מעלות צלזיוס ביעילות לנדוף.
- לאחר דגירה 30 דקות התגובה מתילציה שחייב להפסק כדי למנוע תגובה לא רצויה משנית. הדבר נעשה על ידי הוספת 4 μl של פתרון חומצה אצטית 2M (ב הקסאן) כדי בקבוקון אחד. לאחר סגירת צלוחיות עם כובעים vortexing קצר, דגימות רשאים דגירה עבור 30 דקות אחר.
- מסננים המשמשים להפקת את השלב הזה אדי הם עבודת יד בצורת הציג לא זמינים מסחרית. הם מורכבים צינור טפלון החיצונית (כ 7-8cm רב), שבו מצד אחד צינור היטב הולם זכוכית באורך כ 4cm מוכנס. בצד השני של הצינור טפלון דיסק חלד רשת פלדה נדחף בתוך הצינור עד שהוא מגיע שפופרת זכוכית פנימית על כי כ 20-30mg של בעלי כושר ספיגה (או SuperQ 80/100 (הופסק) או HayeSep ® Q80/100) מתווספים. דיסק נוסף רשת נירוסטה מוכנס ולבסוף קצה של כוס הוא דוחף לתוך צינור טפלון, ובכך בזהירות לחיצה על נירוסטה רשת דיסק על סופג. תמונה מפורטת מסנן מוצג באיור 1.
באיור 1. - בזמן הדגירה של שלב 11, מסננים לאיסוף, הורמונים מפוגל ולכן צמח תנודתי, צריך לשטוף באמצעות 200ul הראשון של מתנול, ולאחר מכן 2 שוטף עם dichloromethane 200ul כל אחד. מרכך שנותרו מסננים הוא פוצץ אז את האוויר. המסננים כעת ניתן להשתמש בהם ללכידה של הורמונים נדיפים באמצעות מיצוי שלב אדי.
- לאחר 30 דקות של דגירה septa הגומי של הבקבוקון כמוסות 4ml נחתכים עם אזמל. כדי לאסוף את הורמונים צמחיים על ידי מיצוי שלב אדי לנקות את המסננים מחוברים קווי ואקום בודדים בקצב הזרימה של כ 800ml/min. המסננים מוכנסים מכן לתוך הבקבוקון דרך septa לחתוך. טיפ קטן pipet מוכנס גם לשמש כניסת אוויר. בחלק הראשוני הזה של ההליך צלוחיות עם מסנני מוכנס צריך שיתקייםבתנוחה זקופה, כדי למנוע כל הנוזל בתוך הבקבוקון להגיע במגע עם קצה מסנן, אשר היה לזהם את המסנן ולאחר מכן גם GC / MS. צלוחיות מתקיימים אז ביד עד שכל הנוזל מתאדה דרך המסנן. ואז צלוחיות עם מסנני מצורף ממוקמים ברחוב חימום חום התאדו תרכובות שנאספו 3min. רכיבים העיקרון של המערכת, כמו גם את הגדרת מתוארים באיור 1. לאחר שלב זה השלב הסופי מיצוי אדי צלוחיות עם מסנני מחוברת עדיין מונחות על מדף ואפשרו להתקרר.
- כאשר המסננים הגיעו לטמפרטורת החדר שוב הם eluted עם 150 מ"ל של dichloromethane לתוך בקבוקון-GC 1.5 מ"ל מצויד להוסיף. אלתר נושף הממס שנותר מסנן את בקבוקוני הם כתרים ונותחו על ידי GC / MS.
גז כרומטוגרף מצויד לפצל / מזרק splitless (מצב splitless 250 ° C, נפח הזרקה 1μ) interfaced כדי ספקטרומטר מסה פעל במצב יינון כימי (CI) אמור לשמש לניתוח). תרכובות מופרדות על עמודת HP-1MS (30 x 0.25mm x 025μm) שנערך 40 ° C עבור 1min לאחר ההזרקה, ולאחר מכן טמפרטורה לתכנת ב 15 ° C / min עד 250 ° C (עבור 10min), עם הליום כנושא גז (0.7ml/min זרם בלתי פוסק). לניתוח MS-מבוסס הן, quadropole (למשל Agilent HP5973) ואת מלכודת יונים מבוססות (למשל וריאן שבתאי 2200) ספקטרומטר מסה יכול לשמש. כמו גז CI או isobutane (מגיע בלוני גז) או מתנול (אדים מן המאגר נוזל משמשים) ניתן להשתמש, לעומת זאת, בכל מקרה שברים של התגובה יינון צריך להיבדק לפני יון שנבחר לספור (SIC) תוכניות נוצרים. השתמשנו את התוכנית הבאה של מערכת GC-MS וריאן 3900/Saturn 2200, מתנול כמו מגיב CI: 5.00-11.30min יונים (M 1) + 153-158 (salicylate מתיל 153, מתיל 2 H 5-סליצילט); 11.30-13.30min יונים (M +1) + 207-228 (מתיל jasmonate 207 ו - 225, מתיל dihydrojasmonate 209 ו - 227); 13.30-16.30min יונים (M +1) + 237-300 (מתיל חומצה abscisic 261, מתיל 2 H 6-abscisic חומצה 267 (חומצה abscisic מייצרת בעיקר [MH 2 O 1] + יונים). תרכובות כל צריך להיות מזוהה על ידי השוואה עם סטנדרטים זמינים מסחרית אותנטי. כימות JA, SA, ו ABA נעשה על ידי correlating באזור השיא (חילוץ יונים) עם אזור השיא (יוני חילוץ) של התקן פנימי בהתאמה מבוססת גם על המשקל הטרי של חומר המשמש את המפעל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן הוכח לעבוד באופן מהימן עבור מגוון רחב של תרכובות צמחים איתות ובלבד גודל ואת האופי הכימי של המתחם אינו למנוע ממנו חילוץ, מפוגל, ו מתאדה. כמו כן, הליך מתילציה כפי שהוא מתואר במסמך זה לא הדרך היחידה של derivatization. Silyllation ו acetylation הן שיטות חלופיות ופרוטוקולים ניתן למצוא בקלות באינטרנט.
אם ספקטרומטר מסה אינו מסוגל יון בודד ניטור מגוון המונית נרשם במהלך הריצה יש להגביל להוציא יונים לא רצויות יותר מדי מן התהליך. לדוגמה, חומצה jasmonic (JA) ופנימיים חומצה jasmonic הסטנדרטי שלה dihydro (dhJA) לייצר שתי הגדולות (M 1) + יונים, 207 ו - 225 עבור JA, ו - 209 ו - 227 עבור dhJA במהלך יינון כימי עם מתנול. כי אלה שני מרכזי (M 1) + ההמונים (207 ו - 225 עבור JA, 209 ו - 227 עבור dhJA) אין שפע באותו rationfor JA ו dhJA, הם צריכים גם להיות חילוץ ושימשו כימות. לכן, בטווח מסה 207-228 אמור להיות מוקלט יונים ספציפיים צריך להיות חילוץ מאוחר יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites. Plant Journal. 39, 790-808 (2004).
- Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. Airborne signals prime plants against insect herbivore attack. PNAS. 101, 1781-1785 (2004).
- Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O´, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants. PNAS. 100, 10552-10557 (2003).
- Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).
