Monitoreo hormonas vegetales en las respuestas de estrés

Summary

Un método simple es a condición de que permite la rápida extracción y análisis de hormonas de plantas múltiples de pequeñas muestras de tejido. El procedimiento utiliza la extracción en fase vapor de la etapa de purificación solemne. Las muestras se analizaron por GC / MS con ionización química que produce principalmente (M +1) + iones.

Abstract

Hormonas de las plantas y los compuestos relacionados con la señalización desempeñan un papel importante en la regulación de la respuesta de las plantas a diversos estímulos ambientales y las tensiones. Entre las tensiones más graves son la herbivoría de insectos, la infección por patógenos, y la sequía. Para cada una de estas tensiones de un conjunto específico de las hormonas y / o combinaciones de ellos son conocidos para afinar las respuestas, asegurando así la supervivencia de la planta. Las principales hormonas implicadas en la regulación de estas respuestas son el ácido jasmónico (JA), el ácido salicílico (SA), y el ácido abscísico (ABA). Para comprender mejor el papel de las hormonas individuales, así como su potencial interacción durante estas respuestas es necesario monitorear los cambios en su abundancia en un temporal, así como de una manera espacial. Para la cuantificación sencilla, sensible y reproducible de estos y otros compuestos de señalización se desarrolló un método basado en la extracción en fase de vapor y la cromatografía de gases / espectrometría de masas (GC / MS) análisis (1, 2, 3, 4). Después de la extracción de estos compuestos en el tejido de la planta por acuosa ácida 1-propanol se mezcla con el diclorometano que contiene ácido carboxílico compuestos metilados, se volatiliza con el calor, y se recogen en un polímero absorbente. Tras la elución a un vial de los analitos se separan por cromatografía de gases y espectrometría de masas detectadas por ionización química. El uso apropiado de las normas internas se permite la cuantificación sencilla, relacionando las áreas de pico de analito estándar e internos.

Protocol

1. En primer lugar tenemos que preparar a los 2 ml con tapa de rosca viales para la extracción: Agregar 400ul de tampón de extracción (1-propanol: H2O: HCl concentrado 2:1:0.002 vol / vol / vol) y 10 l de la norma interna respectiva (10ng/μl ) a un vial. Congelar en nitrógeno líquido y luego agregar las cuentas de cerámica.
2. Añadir el material vegetal (entre 50 y 200 mg), mientras que los viales siguen siendo colocado en el nitrógeno líquido. Tenga en cuenta que el peso del material vegetal añadido tiene que ser estimado antes de proseguir para permitir que más tarde para la cuantificación exacta, que se basa en el peso fresco.
3. Asegúrese de que todo el nitrógeno líquido se evapora antes de cerrar bien el frasco con una tapa. Tenga en cuenta que la tapa tiene que tener un sello de goma para evitar derrames de solventes y por lo tanto, los compuestos extraídos durante la homogeneización.
4. Homogeneizar el tejido en un FastPrep o Precellys homogeneizador molino de bolas a una velocidad de 6000 (para Precellys) durante 30 segundos.
5. Retire los viales de homogeneizador de forma individual, abra la tapa y añada 1 ml de diclorometano para cada muestra. Viales se cierran de nuevo con fuerza y ​​homogeneizar durante 10-15seg en 6000 (Precellys).
6. Transferencia de viales de una centrífuga de mesa y separar la fase orgánica de la fase acuosa a 10.000xg de 60 segundos.
7. Después de la separación de fases de transferencia de la capa inferior verde (fase orgánica, contiene las hormonas y las normas internas) de los viales individuales a un vial de 4 ml de vidrio limpio. Evitar la transferencia de agua (fase superior). Por otra parte, acetato de etilo se puede utilizar en lugar de diclorometano. En ese caso la fase de ethyacetate será la capa superior (verde) y ahora es más fácil de quitar y se transfiere a un vial de vidrio de 4 ml fresco. Al igual que antes, evitar la transferencia de agua.
8. Sople el disolvente con el aire a través de un colector de unos 10-25 minutos (depende de la muestra), consulte con una punta de caudal de aire solo si las muestras están secas (con cuidado). No muestras resecar, para que esto podría causar pérdidas de compuestos.
9. Una vez que las muestras se secan, podemos iniciar la metilación de los ácidos carboxílicos que contienen compuestos en las muestras. En primer lugar, 100 l de una mezcla de diethyether / metanol (9:1 vol / vol) se añaden a cada vial seguido por 4μl de una solución 2M trimethylsilyldiazomethane (en hexano, Sigma Aldrich). Los viales se cierran inmediatamente con un tapón de rosca descapotable equipado con un tabique de silicona recubierto de teflón. Agitar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 25 a 30 minutos.
10. Después de terminar el paso 9, a su vez en un bloque de calefacción y ajuste a la temperatura de la colección que desee. La volatilidad de los compuestos metilados depende de su tamaño, sino también en otros grupos más polares como = O,-OH, y NH. Para el ácido jasmónico y ésteres metílicos de ácidos salicílico una temperatura de recogida de alrededor de 80 ° C son suficientes, mientras que, por ejemplo, otros compuestos como ácidos grasos C18, jasmónico aminoácidos conjugados de ácido, coronatina y éster metílico de ácido 12-oxo-phytodienoic requieren temperaturas entre 180-200 ° C para volatilizar con eficacia.
11. Después de una incubación de 30 minutos la reacción de metilación tiene que ser detenido para evitar una reacción secundaria no deseada. Esto se hace mediante la adición de 4 l de un ácido acético 2M-solución (en hexano) a cada vial. Después del cierre de los viales con tapas y una agitación pocas palabras, las muestras se dejan incubar durante otros 30 minutos.
12. Los filtros utilizados para esta extracción en fase vapor son hechos a mano y en la forma presentada no está disponible comercialmente. Se componen de un tubo exterior de teflón (alrededor de 7 y 8 cm de largo), en la que de un lado se inserta un tubo de vidrio que ajuste bien de unos 4 cm de longitud. En el otro lado del tubo de teflón un disco de acero inoxidable de malla se inserta dentro del tubo hasta que llega al tubo de cristal interior y en que alrededor de 20-30mg de adsorbente (ya sea SuperQ 80/100 (suspendido) o HayeSep ® Q80/100) se agregan. Otro disco de acero inoxidable de malla se inserta y, finalmente, una punta de vidrio se lleva en el tubo de teflón, con lo que presionar con cuidado el disco de malla de acero inoxidable en el absorbente. Una descripción detallada de un filtro se muestra en la figura 1.
    
    Figura 1.
13. Durante el tiempo de incubación del paso 11, los filtros para la recogida de la metilación y por lo tanto, hormonas vegetales volátiles, tienen que ser lavados con 200ul primero de metanol, y luego de 2 lavados con diclorometano 200ul cada uno. Disolvente que queda en los filtros es entonces volado por el aire. Los filtros se pueden utilizar ahora para la captura de las hormonas volátiles a través de la extracción en fase vapor.
14. Después de 30 minutos de incubación de los septos de goma del vial de 4 ml tapas se cortan con un bisturí. Para recoger las hormonas de plantas por extracción en fase vapor de limpieza de los filtros se conectan a las líneas de vacío individual en un caudal de aproximadamente 800ml/min. Los filtros se insertan en el vial a través de los tabiques de corte. Una pequeña punta de la pipeta se inserta también para actuar como una entrada de aire. Durante esta parte inicial del procedimiento de los viales con los filtros han insertado, que se celebraráen posición vertical para evitar que cualquiera de los líquidos en el interior del vial para ponerse en contacto con la punta de filtro, que contaminaría el filtro y, posteriormente, también el GC / MS. Los viales están entonces en poder de la mano hasta que el líquido se evapora a través del filtro. A continuación, los viales con los filtros adjunta se colocan en el bloque de calentamiento y se evapora al calor compuestos recogidos por 3 minutos. Los principales componentes del sistema, así como la configuración se muestra en la figura 1. Después de esta etapa de extracción final de la fase de vapor de los viales con los filtros siguen unidos se colocan sobre una rejilla y dejar enfriar.
15. Cuando los filtros han llegado a la temperatura ambiente una vez más se eluyó con 150 ml de diclorometano en un 1,5 ml GC-vial equipado con una inserción. Alterar soplar el disolvente restante del filtro de los frascos se tapan y se analizaron por GC / MS.

Un cromatógrafo de gases equipado con un split / splitless inyector (el modo splitless 250 ° C, el volumen de inyección 1μ) interfaz con un espectrómetro de masas que opere en modo de ionización química (CI) debe ser utilizado para el análisis). Compuestos se separan en HP-1MS columna (30m x 0.25mm x 025μm) se mantiene a 40 ° C durante 1 minuto después de la inyección, y luego la temperatura programada a 15 ° C / min a 250 ° C (de 10 minutos), con helio como el portador gas (0.7ml/min flujo constante). Para el análisis basado en MS tanto, un quadropole (por ejemplo, Agilent HP5973) y una trampa de iones basados ​​en (por ejemplo, Varian Saturn 2200) espectrómetro de masa se puede utilizar. Como un gas isobutano o CI (viene en los tanques de gas) o metanol (los vapores de un depósito de líquido se utilizan) se puede utilizar, sin embargo, en cada caso, los fragmentos de la reacción de ionización se debe comprobar antes de que el selectivo de iones contar (SIC) los programas de se crean. Hemos utilizado el siguiente programa para un sistema de GC Varian 3900/Saturn MS 2200 y el metanol como reactivo IC: 5.00-11.30min iones (M +1) ⁺ 153-158 (salicilato de metilo 153, metil ² H _{5-salicilato);} 11.30-13.30min iones (M +1) ⁺ 207 a 228 (metil jasmonato 207 y 225 de metilo dihidrojasmonato 209 y 227); 13.30-16.30min iones (M +1) ⁺ 237-300 (metil ácido abscísico 261, metil ² _H-6 ácido abscísico 267 (ácido abscísico produce predominantemente [MH ₂ O +1] ⁺ iones). Todos los compuestos deben ser identificados por comparación con estándares auténticos disponibles en el mercado. Cuantificación de JA, SA, y ABA se realiza mediante la correlación de la superficie del pico (extraído iones) con el área del pico (iones extraídos) de la norma interna respectiva y también se basa en el peso fresco del material vegetal utilizado.

Discussion

El método que aquí se presenta se ha demostrado que funciona de forma fiable para una amplia gama de compuestos de señalización de las plantas, siempre que el tamaño y la naturaleza química del compuesto no impedir que se extrae, desnaturalizado, y se vaporiza. Además, el procedimiento de metilación como se describe en este documento no es la única forma de derivación. Silyllation y la acetilación de métodos alternativos y los protocolos se pueden encontrar fácilmente en línea.

Si el espectrómetro de masas no es capaz de iones de un solo control del rango de masas que se registra durante un proceso debe ser limitado para excluir a los iones no deseados demasiado en el proceso. Por ejemplo, el ácido jasmónico (JA) y su patrón interno ácido dihidro jasmónico (dhJA) producen dos importantes (M +1) ⁺ iones, 207 y 225 de JA, y 209 y 227 de dhJA durante la ionización química con metanol. Debido a que estos dos grandes (M +1) ⁺ masa (207 y 225 de JA, 209 y 227 para dhJA) no tienen la misma abundancia rationfor JA y dhJA, ambos deberían ser extraídos y utilizados para la cuantificación. Por lo tanto, una amplia masa de 207 a 228 deben ser registrados y los iones específicos deben ser extraídos después.