Summary
هذا الإجراء يستخدم الضوء الأزرق تنشيط قناة الطحالب والخلايا أدوات محددة التعبير الجيني لاستحضار إمكانات متشابك مع نبضات ضوئية عند تقاطع العصبية والعضلية (NMJ) في
Abstract
و
Protocol
الجزء 1 : رعاية الحيوان والصلبان الوراثية
- الحفاظ على UAS - ChR2 وخطوط الطيران OK371 - GAL4 في زجاجات تحتوي على سائل الاعلام منفصلة تطير القياسية 8.
- جمع العذارى من خطوط الطيران OK371 - GAL4 والذكور من UAS - ChR2 خطوط.
- وضع كل من الذكور والإناث في قارورة تحتوي على وسائل الاعلام يطير معيار مختلطة مع 1 ملم ريتينال مفروق (ATR). وينبغي بذل ATR الغذاء وسائل الاعلام ذوبان الطيران العادية الأولى في الميكروويف لمدة دقيقة 1 ~. ذابت مرة واحدة ، والسماح لتبرد لمدة حوالي 30 ثانية لمدة دقيقة واحدة ثم قم بإضافة 100 ميكروليتر من 100 ملي ATR في ETOH 100 ٪ لكل 10 مل من وسائل الإعلام الطيران. قارورة مكان على الجليد ، ثم تخزين في منطقة مظلمة في 4 درجات مئوية.
- اسمحوا لم الذباب وتضع بيوضها في منطقة مظلمة في 22-25 درجة مئوية.
- الانتظار 3-4 أيام حتى 3 طور مرحلي اليرقات مرئية ، وفي هذه النقطة ، والتخلص من الذباب الكبار.
الجزء 2 : الزي الإعداد
- إرفاق أي 10X تشريح العين نطاق قطعة (في حالتنا ، من شركة كارل زايس ، www.zeiss.com ، Thornwood ، NY) ، لLED زرقاء مصدر الضوء مع بالوعة الحرارة (ثور مختبرات ، www.thorlabs.com ، نيوتن ، نيوجيرسي ). نعلق على قاعدة مغناطيسية مع آخر والمشبك. غطاء بالوعة حرارة الارض مع درع كهربائيا للحد من الضوضاء الكهربائية المولدة من مصدر الضوء.
- قاعدة مكان المغناطيسي مع مصدر الضوء على الجدول الجوي للتلاعب الكهربية.
- ربط مصدر الضوء للسيطرة على الدوائر وربط دائرة التحكم بمصدر التيار الكهربائي الخارجي (Powerlab 30/04 ، ADInstruments ، www.adinstruments.com ، كولورادو سبرينغز ، أول أكسيد الكربون).
- 1-5 تعطي نبضات الخامس للسيطرة على حلبة لتفعيل الضوء الأزرق.
- ضبط قاعدة المغناطيسية ومصدر الضوء الأزرق حتى يتم تركيز شعاع من الضوء على المنطقة التي سوف يشغلها تشريح اليرقات.
الجزء 3 : تشريح
- مكان six 0.1 ملم دبابيس الحشرات في الكلمة من صحن sylgard مبطنة.
- إزالة 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة من وسائل الاعلام الغذائية والبلاستيك مكان في أي طبق بيتري.
- شطف اليرقات مع المياه المالحة لإزالة المواد الغذائية.
- اليرقات في مكان تشريح الطبق بالقرب من دبابيس سحبت المالحة وإضافة إلى مستوى نصف.
- توجيه اليرقات بحيث يمكنك رؤية أنبوبين فضي (القصبة الهوائية) على طول سطح الحيوان الظهرية.
- اضافة الى وجود دبوس كبيرة مباشرة في الذيل في أنابيب القصبة الهوائية بين. عقد اليرقات أسفل ووضع دبوس كبير ثان في رأسه ، ويجري التأكد أن تمتد خارج الجسم بالطول.
- إجراء شق صغير بالقرب من الذيل ، ويستمر الامر على طول الجسم. تأكد من أن تثار نصائح من المقص بحيث لا بطريق الخطأ قطع الأعصاب البطنية و / أو عضلات جدار الجسم.
- قبل أربعة دبابيس على الزوايا الأربع من الحيوان القسم الوسطي الآن مفتوحة. مجموعة منهم في طبق تشريح بحيث فيليه الحيوان. دبوس إعداد تدرس بها.
- باستخدام ملقط ومقص ، وإزالة أحشاء الحيوان والقصبة الهوائية والهيئات الدهون.
- شطف الإعدادية مع المالحة.
- موقع الفص الجبهي (كما هو مبين في الشكل) والعقدة البطنية من الإعدادية.
- باستخدام المقص الصغير ، وقطع بعناية من خلال العقدة البطنية خلف الفص الجبهي.
4 منه : تسجيل العضلات وتحفيز الضوء الأزرق
- سحب كهربائي 10-20 μω باستخدام مجتذب القطب الإلكترونية (سوتر الآلات).
- ملء القطب انسحب مع بوكل م 3.
- شغل مكان في القطب الكهربائي حامل والمناورة مع طرف القطب micromanipulator الإعدادية بالقرب من اليرقات تحت مجهر تشريح على تلاعب الكهربية.
- تحديد العضلات 6 (M6) في أي جزء جدار الجسم (الشكل A).
- إدراج بعناية في القطب M6 ومشاهدة لفرط الاستقطاب السريع. وينبغي أن إمكانات غشاء يستريح العضلات تكون في أي مكان من -30 إلى -70 فولت MV.
- ضبط الضوء الأزرق بحيث يتركز الإعدادية تشريح في شعاع ضوء.
- 2-10 تعطي نبضات الجهد للسيطرة على حلبة مللي. زيادة تدريجية الجهد الموردة للسيطرة على الحلبة. لمشاهدة إمكانيات تقاطع مثير في الخلية العضلية (1B الشكل).
ممثل النتائج :
1A يظهر الرقم التخطيطي للإعداد وتسجيل وإعداد شرائح. 1B يوضح الشكل النموذجي EJP التي حركها نبضات ضوئية قصيرة. تتلخص EJP السعة السعة يظهر من الخلايا العصبية الحركية المعروفان لكلا يعصب M6. انخفاض شدة الضوء الوحيد تنشيط الحركية وحدة واحدة (لا تظهر البيانات).
الشكل 1 : والتخطيطي) من العام منصة تسجيل داخل الخلايا والأزرق مع الصمام. تتم إزالة المخ (برازيلي) لكبح النشاط الإيقاعي في بطني عقدة (جيد جدا). وأعرب عن ChR2 في الخلايا العصبية الحركية باستخدام نظام GAL4 - UAS. ب) تسجيل من بين الخلايا العضلية M6. 40 مللي نبضات الضوء الأزرق (في 127 μW / مم 2) استحضار موثوق متشابك امكانات كبيرة (النجمة) في M6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة إشراك كل من التشريح الأولي ودخول الخلايا العضلية. إذا كان يتم قطع الأعصاب أو تلف العضلات أثناء تشريح الأولية أنه من الصعب الاستمرار في بقية التجربة. أثناء تشريح ، يجب على المرء أن يكون حذرا للغاية لمقص تشريح زاوية صعودا أكبر قدر ممكن من خلال شق الظهرية. خلال الخطوة الحاسمة الثانية ، تدخل الخلايا العضلية ، لا بد من مشاهدة لفرط الاستقطاب الماضي ~ 30 فولت. القيم أعلاه بالسيارات -30 تشير إلى أن القطب هو إما غير صحيح داخل الخلايا العضلية أو في زنزانة غير صحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا أي تضارب في المصالح في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1GM - 33205 067284 وMH - LC لغريفيث وصيف جامعة برانديز المنح الدراسية الجامعية لبحوث Hornstein نيوجيرسي. وأجريت تجارب أولية لهذه التقنية في المختبر البيولوجي البحري كجزء من الأنظمة العصبية والسلوكية 2008 دورة صيفية (NIMH المنحة : MH059472 R25) في وودز هول ، MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
