Summary
Este procedimento utiliza um canal activado pela luz azul de algas e células específicas de ferramentas de expressão genética para evocar potenciais sinápticos com pulsos de luz na junção neuromuscular (MNJ), em
Abstract
O
Protocol
Parte 1: o cuidado de animais e cruzes genética
- Manter-UAS ChR2 e linhas OK371-GAL4 voar em frascos separados contendo media voar padrão 8.
- Coletar virgens de linhas OK371-GAL4 e machos de mosca-UAS ChR2 linhas.
- Coloque os machos e as fêmeas em um frasco contendo media voar padrão misturado com 1 mM all-trans retinal (ATR). ATR alimentos deve ser feita pelo primeiro derretimento media voar regularmente no microondas por 1 minuto ~. Uma vez derretido, deixe esfriar por cerca de 30 segundos a um minuto e depois adicionar 100 l de 100 mM ATR em 100 ETOH% para cada 10 ml de mídia voar. Frascos colocar no gelo e guarde em uma área escura a 4 ° C.
- Deixe-companheiro de moscas e depositam os ovos em uma área escura em 22-25 ° C.
- Aguarde 3-4 dias até 3 larvas são visíveis; nesse ponto, dispor de moscas adultas.
Parte 2: setup Rig
- Anexar qualquer parte do olho 10x dissecar escopo (no nosso caso, da Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), a fonte de luz LED azul com dissipador de calor (Thor laboratórios, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Anexar a base magnética com pós e grampo. Cobrir dissipador de calor com uma blindagem eletricamente aterrado para reduzir o ruído elétrico gerado pela fonte de luz.
- De base local com campo magnético com fonte de luz no ar tabela de eletrofisiologia rig.
- Conectar fonte de luz para o controle de circuito e circuito de controle para conectar fonte de tensão externa (Powerlab 30/04, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
- Dê 1-5 pulsos V para circuito de controle para ativar a luz azul.
- Ajuste base magnética e fonte luz até feixe de luz azul é focada em área a ser ocupada por dissecção larval.
Parte 3: Dissection
- Coloque seis pinos 0,1 milímetros de insetos no chão de um prato Sylgard-alinhado.
- Remover um 3 º larvas a partir da mídia de alimentos e coloque em qualquer plástico Placa de Petri.
- Enxaguar com soro fisiológico larvas para remover alimentos.
- Larvas lugar em dissecar prato perto os pinos puxado e adicionar soro fisiológico para o nível ½.
- Orientar as larvas de modo que você pode ver dois tubos prateados (traquéia) correndo ao longo da superfície dorsal do animal.
- Insira um alfinete grande diretamente na cauda entre os tubos traqueais. Segure as larvas para baixo e colocar um segundo pino grande em sua cabeça, certificando-se de esticar o corpo no sentido longitudinal.
- Fazer uma pequena incisão perto da cauda, e continuá-la até o comprimento do corpo. Certifique-se que a ponta da tesoura são criados de modo a não cortar acidentalmente nervos ventral e / ou músculos da parede do corpo.
- Coloque quatro pinos nos quatro cantos do animal agora midsection aberto. Colocá-las no prato de dissecação, de modo a fillet do animal. Preparação de pinos para fora ensinado.
- Utilizando uma pinça e tesouras, remover vísceras do animal, traquéia e dos órgãos de gordura.
- Lavar a preparação com solução salina.
- Localize os lobos frontais (como visto na Fig. A) e gânglio ventral da prep.
- Usando micro-tesoura, corte cuidadosamente através do gânglio ventral logo atrás dos lobos frontais.
Parte 4: gravação muscular e estimulação luz azul
- Puxar um eletrodo 20/10 μω usando um extrator de eletrodo eletrônico (Sutter Instruments).
- Preencha o eletrodo puxado com 3 M KCl.
- Lugar cheio de eletrodos no suporte do eletrodo e eletrodo manobra com um micromanipulador perto prep larval sob microscópio de dissecação em eletrofisiologia rig.
- Identificar Muscle 6 (M6) em qualquer segmento da parede do corpo (Fig. A).
- Insira cuidadosamente eletrodo em M6 e assistir a hiperpolarização rápida. Potenciais musculares em repouso da membrana deve ser em qualquer lugar de -30 mV a -70 mV.
- Ajuste a luz azul, para que prep dissecados está centrado em feixe de luz.
- Dê 2-10 pulsos de voltagem ms para controlar circuito. Gradativamente aumentar a tensão fornecida ao circuito de controle. Preste atenção para potenciais de junção excitatórios em células musculares (Figura 1B).
Resultados representativos:
Figura 1A mostra um esquema da configuração de gravação e preparação em filetes. A Figura 1B mostra EJP típico evocado por pulsos curtos de luz. EJP amplitude mostrado é resumida amplitude de dois neurônios motores inervam conhecida por ambos M6. Intensidades mais baixas de luz ativado somente uma unidade de motor (dados não mostrados).
Figura 1: Um esquema) General de uma plataforma de gravação intracelular e com LED azul. Cérebro (Br) é removido para inibir a atividade rítmica no gânglio ventral (VG). ChR2 é expressa em neurônios motores usando o sistema GAL4-UAS. B) a gravação de um músculo Intracelular M6. 40 ms pulsos de luz azul (em 127 μW / mm 2) de forma confiável evocam grandes potenciais sinápticos (asteriscos) no M6.
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Discussion
Passos críticos envolvem tanto a dissecção inicial e à entrada das células musculares. Se os nervos são cortados ou músculo está danificado durante a dissecção inicial é difícil continuar o resto do experimento. Durante a dissecção, deve-se ter muito cuidado para dissecar ângulo tesoura para cima, tanto quanto possível durante a incisão dorsal. Durante a segunda etapa crucial, entrando em uma célula muscular, deve-se prestar atenção para uma hiperpolarização passado ~ 30 mV. Valores acima de -30 mV indicam que o eletrodo não for adequadamente dentro de uma célula muscular ou em uma cela insalubre.
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Disclosures
Nós não temos conflitos de interesse de divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health concede RO1GM-33205 e MH-067284 a LC Griffith e por uma bolsa de estudos da Universidade de Verão de pesquisa Brandeis graduação para NJ Hornstein. Experimentos preliminares para esta técnica foram realizados no Laboratório de Biologia Marinha, como parte do 2008 Sistemas Neurais e Comportamento curso de verão (NIMH subvenção: R25 MH059472) de Woods Hole, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
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- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
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- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
