Summary
यह वीडियो Arabidopsis की 14 दिन पुरानी seedlings के ऊतकों से बरकरार protoplasts अलग करने के लिए एक प्रक्रिया से पता चलता है. यह देखते हुए कि पृथक protoplasts कम से कम 96h के लिए बरकरार रह रहे हैं और एक महीने की उम्र में परिपक्व पौधों के बजाय seedlings से अलग है, इस प्रक्रिया बरकरार protoplasts की आवश्यकता assays expedites.
Abstract
Protoplasts संयंत्र कोशिकाओं पड़ा है कि अपने सेल दीवारों enzymatically हटा रहे हैं. विभिन्न संयंत्र के ऊतकों से protoplasts के अलगाव पहले अधिक से अधिक 40 साल पहले की सूचना मिली थी
Protocol
भाग 1. पौधों से बढ़ के लिए ठोस माध्यम तैयार करना.
हम आम तौर पर ध्यान केंद्रित Murasige और Skoog मध्यम (एमएस) पर संस्कृति पौधों 1% sucrose और अगर 0.7% के साथ पूरक. यह पौधों को स्वस्थ रखने के लिए सभी आवश्यक सामग्री शामिल हैं.
एमएस के 1L, मीडिया पीएच 5.7 की तैयारी के लिए
- 1.5 2.0L Autoclavable बोतल में पानी की 800 मिलीलीटर में एमएस पाउडर के 2.15 छ जोड़ें.
- बोतल में सरगर्मी बार प्लेस और एक भावप्रवण प्लेट पर मध्यम सरगर्मी से एमएस पाउडर भंग.
- जबकि भावप्रवण, जोड़ने के लिए, ड्रॉप द्वारा ड्रॉप, 1N KOH 5.7 एमएस माध्यम से पीएच को समायोजित करने के लिए.
- Sucrose के 10 ग्राम जोड़ें, भावप्रवण रहते हैं.
- अगर के 7 ग्राम जोड़ें *.
- 1000 मिलीलीटर के लिए तैयार मध्यम के अंतिम मात्रा समायोजित और autoclaving द्वारा बाँझ .*
- प्लेस एक भावप्रवण प्लेट पर मध्यम autoclaved और इसे शांत जबकि भावप्रवण, तो, कि अगर बोतल के नीचे वेग नहीं होगा. नीचे ~ ° * सी. 60 मध्यम कूल
- 100 मिमी पेट्री प्लेटें डालो. 4 में प्लेटें रखें डिग्री सेल्सियस
* 1 टिप: अगर भंग करने का प्रयास नहीं करो. Autoclaving दौरान solubilize जाएगा.
* टिप 2: autoclaving के दौरान एक बोतल में सरगर्मी पट्टी रखें, आप इसे बाद में की आवश्यकता होगी.
* युक्ति 3: यदि आप 10 के लिए autoclaved बोतल पर तुम हाथ रख कर सकते हैं, यह मतलब है कि मध्यम नीचे ठंडा है पर्याप्त और आप प्लेटों डालने का कार्य शुरू कर सकते हैं.
भाग 2. संयंत्र सामग्री और विकास की स्थिति.
- Arabidopsis thaliana के बीज जीवाणुरहित
- Eppendorf microcentrifuge ट्यूबों में बीज के 100 मिलीग्राम प्लेस और 70% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें. अच्छी तरह से मिलाएं और 2 मिनट के लिए सेते हैं. बीज नीचे स्पिन, aspirate सतह पर तैरनेवाला.
- 1.8% ब्लीच समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें * 0.1% बीच 20 से युक्त. 10 मिनट के लिए मिश्रण. नीचे बीज और aspirate ब्लीच समाधान स्पिन.
- इस कदम के लिए एक लामिना का प्रवाह हुड में किया जा सकता है. बीज बाँझ पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से. नीचे स्पिन बीज, पानी aspirate. इस कदम 5 बार दोहराएँ.
- 1 प्लेटें कदम (100 बीज / प्लेट) में तैयार पर बीज बिखरा हुआ है.
- 24-48 घंटे के लिए वरीयता प्राप्त प्लेटें 4 बजे ° रखें स्तरीकरण के लिए अंधेरे में सी.
- विकास कक्ष में 14 दिनों के लिए पौधों 8 घंटे light/16 घंटे अंधेरे photoperiod (एक संश्लेषक 250 μmol मीटर -2 एस -1 के फोटॉन प्रवाह घनत्व पर) के साथ 23 / 19 ° सी प्रकाश / अंधेरे तापमान शासन बढ़ो और 75 % रिश्तेदार नमी.
* टिप 1: ब्लीच समाधान एक घरेलू Clorox कमजोर पड़ने अप किया जाता है है, 6% सोडियम hypochlorite युक्त और 0.1% की एक अंतिम एकाग्रता बीच-20 जोड़ने.
भाग 3. Arabidopsis seedlings से protoplasts के अलगाव.
- फिल्टर निष्फल TVL समाधान के 15 मिलीलीटर में एक ताजा धार के साथ 14 दिन पुरानी seedlings के 2 जी स्लाइस. हम बाँझ डिस्पोजेबल पेट्री डिश में संयंत्र सामग्री काट.
- 200 मिलीलीटर बीकर में कटा ऊतकों स्थानांतरण करने के लिए, फिल्टर निष्फल एनजाइम समाधान, एनजाइम समाधान के साथ ऊतकों मिश्रण है, parafilm और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करने के लिए बीकर ज़ुल्फ़ के 20 मिलीलीटर जोड़ें.
- अंधेरे में 35 rpm पर कमरे के तापमान पर 16-18 एच. के लिए संयंत्र के ऊतकों हिलाएँ
- 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में पनीर कपड़े का 8 परतों, W5 समाधान में पूर्व गीला के माध्यम से sieving द्वारा जारी protoplasts लीजिए.
- W5 समाधान के 15 मिलीलीटर के साथ कपड़े धोने के द्वारा पनीर कपड़े अधिक समय से चलनी protoplasts.
- ध्यान, चीनी ढाल W5 समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ उपरिशायी protoplasts परेशान नहीं करते, 100 पर 7 मिनट जी के लिए अपकेंद्रित्र
- एनजाइम समाधान और W5 समाधान (छवि 1B) के इंटरफ़ेस में protoplasts के 10 मिलीलीटर लीजिए और एक नया 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब को हस्तांतरण.
- जी 60 में 5 मिनट के लिए 15 मिलीलीटर W5 समाधान, अपकेंद्रित्र जोड़ें सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 5min के लिए 60 ग्राम धो समाधान अपकेंद्रित्र, 15ml W5 में protoplasts resuspending एनजाइम समाधान से मुक्त protoplasts
- 1-3ml W5 समाधान में सतह पर तैरनेवाला, resuspend pelleted protoplasts निकालें.
- Hemocytometer साथ गिनती सेल द्वारा मूलतत्त्व उपज का मूल्यांकन.
भाग 4. अभिकर्मकों:
TVL: 0.3 sorbitol एम, 50 मिमी CaCL 2 सी. फ़िल्टर बाँझ और -20 पर दुकान °
एनजाइम समाधान: 0.5 एम sucrose, 10 मिमी एमईएस - KOH [5.7 पीएच] मिमी 20 2 CaCl, 40 मिमी KCl, 1% Cellulase (Onozuka आर 10), 1% Macerozyme (R10). फ़िल्टर - बाँझ और हौसले का उपयोग करें.
W5 समाधान: 0.1% (w / v) ग्लूकोज, 0.08% (w / v) KCl, 0.9% (w / v) NaCl, 1.84% (w / v) 2 CaCl, 2 मिमी एमईएस KOH 5.7 पीएच. फ़िल्टर बाँझ और कमरे के तापमान पर स्टोर.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:
Arabidopsis संस्कृति भाग 1 और 2 में वर्णित शर्तों का उपयोग स्वस्थ पौधों, renders protoplasts (छवि 1A) को अलग करने के लिए उपयुक्त है. हेतु प्रोटोप्लास्ट sucrose के घनत्व gradi द्वारा शुद्ध कर रहे हैंent centrifugation और W5 एनजाइम और समाधान (छवि 1B) के इंटरफ़ेस में एकत्र. मूलतत्त्व अलगाव भाग 3 में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग हम आम तौर पर ताजा seedlings के एक ग्राम से 10 5-10 बरकरार protoplasts के 6 (छवि 1C ) फसल.
चित्रा 1. Arabidopsis seedlings से protoplasts के अलगाव. ए, Arabidopsis की 14 दिन पुरानी seedlings से ऊतकों एकत्र थे और protoplasts करने के लिए परिवर्तित एक संशोधित की प्रक्रिया (चेन और Halkier, 2000) द्वारा बी. Protoplasts sucrose के घनत्व ढाल centrifugation द्वारा शुद्ध थे और एंजाइम समाधान के इंटरफेस में एकत्र और W5 uffer (सफेद तीर) सी, protoplasts के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी. Microphotographs ठंडा सीसीडी कैमरा Zeiss Axioscope 2 प्लस खुर्दबीन के साथ interfaced का उपयोग कर एकत्र किए गए थे.
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Discussion
बरकरार मूलतत्त्व की उच्च उपज सुनिश्चित करने के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है स्वस्थ पौधों के साथ शुरू. Protoplasts अलग करने के लिए फिल्टर बाँझ समाधान का उपयोग करें. याद रखें कि protoplasts नाजुक रहे हैं. इसलिए, जब आप protoplasts संभाल रहे हैं, मिश्रण नहीं pipet या उन्हें भंवर सख्ती के बाद से यह उन्हें ब्रेक करते हैं. इसके बजाय, धीरे धीरे घूर्णन या अपकेंद्रित्र ट्यूब टेप protoplasts मिश्रण. वर्णित प्रक्रिया उपज बरकरार protoplasts कि कम से कम 96 एच. के लिए व्यवहार्य कर रहे हैं इसलिए, protoplasts प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण, अलगाव और बरकरार organelles और डबल असहाय शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई), 3-5 आदि द्वारा लक्षित जीन निष्क्रियता के विश्लेषण के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं के एक किस्म का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
अनंतिम संयंत्र जीन की कार्यात्मक विश्लेषण में इसके उपयोग के लिए इस प्रक्रिया का वर्णन पेटेंट प्रौद्योगिकी उद्यम और व्यावसायीकरण के लिए कॉर्नेल केंद्र (CCTEC), जून 2008 के साथ दायर किया गया है. डॉकेट नहीं 50341/015001: Vatamaniuk, ठीक है, और झाई, जेड संयंत्र जीन की तेजी से कार्यात्मक विश्लेषण के लिए विधि.
Acknowledgments
इस काम के कार्नेल विश्वविद्यालय कृषि प्रयोग स्टेशन (CUAES) NYC 125,433 हैच अनुदान और कॉर्नेल प्रारंभ अप OKV के लिए सम्मानित किया अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MurashigeandSkoogBasalSaltMixture(MS) | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| PetriDishes(100x15mm) | Krackeler Scientific, Inc. | 82-4001 | |
| Cellulase(OnozukaR‐10) | Research Products International Corp. | C32200 | |
| Macerozyme(R10) | Research Products International Corp. | M22010 | |
| Cheeseclothwipes | Fisher Scientific | 06-665-29 | |
| LabRotator | Fisher Scientific | 1167152Q | |
| AllegraX‐15RCentrifuge | VWR international | 392932 | |
| Axioskop2PlusMicroscope | Carl Zeiss, Inc. |
References
- Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
- Chen, S., Halkier, B. A. Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus. J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).
- Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts. Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).
- Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts. Plant Phys. 149, 642-652 (2009).
