Summary
In questo articolo vi presentiamo un protocollo generale per la misurazione della durata di nematodi mantenuto su un supporto solido con UV ucciso cibo batterica.
Abstract
L'invecchiamento è un processo degenerativo caratterizzato da un progressivo deterioramento delle componenti cellulari e gli organelli con conseguente mortalità. Il nematode
Protocol
Parte 1: Preparare nematode crescita media (NGM) piastre
Questa sezione descrive la preparazione dei piatti NGM solido per l'uso nella sperimentazione durata della vita. Un esperimento di base durata della vita richiede due tipi di piastre: piastre NGM standard, che non contengono additivi, e Amp / FUDR piatti, che hanno entrambi ampicillina (Amp) e fluorodeoxyuridine (FUDR) aggiunto al NGM. L'ampicillina è usata per prevenire la contaminazione batterica stranieri. FUDR inibisce la divisione cellulare, riduce la produzione di uova, e previene le uova da cova. L'uso di FUDR per l'analisi longevità non influisce durata vita adulta ed elimina la necessità di trasferire i vermi ogni pochi giorni al fine di separarli dalle larve in crescita. Entrambi i tipi di piastre sono seminati con E. coli OP50 batteri, che viene successivamente ucciso da esposizione ai raggi UV.
- Preparare NGM (vedi sezione 5 per ricetta e le note di stoccaggio) e piastre Petri etichetta. Avrete bisogno di 1 60 mm Piastra di Petri per 10 ml di NGM. Se si inizia con NGM solido precedentemente preparato, passare al punto 1.2. Se si inizia con NGM appena sterilizzati in autoclave, passare al punto 1.4.
- Completamente sciogliere NGM solido microonde in alto di 30 impulsi secondo. Mezzi di turbolenza tra gli impulsi per evitare bolle di gas pressurizzato da costruire.
- Luogo NGM liquido in bagno d'acqua a 55 ° C o in panchina a raffreddare.
- Una volta NGM raggiunge i 55 ° C, aggiungere 33 ml di FUDR 150 mm e 100 ml di 100 mg / ml per 100 ml Ampicillina NGM (per Amp / FUDR piatti) e mescolare. Per piastre NGM senza farmaci aggiuntivi passare direttamente al punto 1.5.
- Usando la tecnica sterile, pipetta 10 mL NGM in ogni piatto 60 millimetri di Petri. Evitare la formazione di bolle, se possibile. Se le bolle si formano, possono essere spuntato con un puntale.
- Lasciare le piastre sul banco con coperchi a permettere NGM solidificare e asciugare. Se possibile, lasciare le piastre sul banco per 2 giorni prima di aggiungere i batteri, ma 1 giorno funzionerà se le targhe sono necessarie prima.
- Il giorno prima le piastre finitura essiccazione, liquido cultura seme LB con una singola colonia da una vena fresca di E. coli OP50 batteri su agar LB. Si dovrebbe preparare almeno 1 ml di una notte OP50 cultura a 60 mm.
- Luogo OP50 cultura in 37 ° C shaker e permettere ai batteri di crescere durante la notte (la cultura dovrebbe raggiungere la saturazione).
- Pellet OP50 batteri facendo girare a 3.500 g per 10 minuti.
- Rimuovere il 90% dei batteri surnatante e risospendere di concentrarsi cultura 10x.
- Pipettare 100 l di 10x concentrata OP50 cultura al centro delle piastre NGM solidificato. Agitare delicatamente piatti di diffondere la cultura dei batteri, se necessario (idealmente batteri dovrebbero coprire l'area centrale della NGM senza entrare vicino alle mura della piastra). Cercate di evitare di toccare la punta della pipetta sulla superficie della NGM, come difetti nella superficie del supporto permettono i vermi a scavare nel NGM.
- Lasciare le piastre sul banco durante la notte per permettere ai batteri di cultura asciugare sul NGM solido (in genere dura circa 24 ore).
- Una volta asciutto, esporre la superficie delle piastre ad una dose UV sufficiente ad arrestare la crescita dei batteri. Se si utilizza un Stratalinker UV Stratagene 2400:
- Piastre posto nella Stratalinker e togliere coperchi
- Chiudere la porta e accendere la Stratalinker
- 'Energia' stampa
- Inserisci '9999 'usando la tastiera
- 'Start' stampa
- Le piastre saranno esposti a raggi UV per circa 5 minuti
- Piastre con batteri uccisi UV possono essere conservati a testa in giù a 4 ° C per un massimo di 1 mese.
Parte 2: Eseguire un uovo di tempo che per acquisire un età sincronizzato popolazione di animali
In questa sezione abbiamo generare una popolazione di vermi con un comune tratteggiati data. Questo si ottiene agli adulti sessualmente attivi di deporre le uova su un piatto per un periodo definito di tempo e consentendo a tali uova di svilupparsi.
- (Opzionale) Trasferimento di circa 20 vermi adulti giovani per un piatto fresco senza FUDR NGM. Lasciare le piastre a 25 ° C al fine di consentire worm di propagarsi attraverso e mangiare tutto il cibo batterica. Dopo che il cibo dei batteri è stato consumato vermi appena schiusi entrerà nella fase di crescita arrestato dauer. Si inizierà a vedere la larva dauer circa entro una settimana, a seconda di quanti vermi si trasferisce alla piastra inizialmente. Dauer larva può essere utilizzato per i passi successivi per un massimo di 1 mese.
- (Opzionale) Trasferimento 20-30 larva dauer ad una piastra NGM fresca senza FUDR. In presenza di larve cibo dauer diventeranno adulti sessualmente attivi entro 2 giorni e rimangono sessualmente attivi per alcuni giorni in seguito a 25 ° C.
- Trasferimento 10-15 adulti sessualmente attivi ad una piastra NGM fresca senza FUDR. Questo piatto è denominato deposizione delle uova a tempo (TEL) piastra.
- Lascia la piastra TEL a 25 ° C per 6 ore al fine di consentire tha tempo worm per deporre le uova.
- Togliere i vermi adulti dal piatto TEL. Piastra può essere ispezionato visivamente per le uova prima di rimuovere gli adulti. Se il worm non hanno gettato un numero sufficiente di uova della piastra TEL può essere lasciato a 25 ° C fino a un totale di 24 ore prima di rimuovere i vermi adulti.
- Luogo TEL piastra a 20 ° C fino a quando le uova si sono schiuse e il worm si sono sviluppati allo stadio larvale L4 (solitamente ciò richiede 2 giorni per tipo selvaggio C. elegans, ma può richiedere più tempo per i ceppi con fenotipo lento sviluppo).
Parte 3: gli animali Punteggio per la durata della vita
In questa sezione seguiamo l'età sincronizzato popolazione di vermi da parte 2 fino alla morte. I worm sono mantenuti in Amp / FUDR piastre per prevenire la produzione di uova e di contaminazioni batteriche e sono considerati morti se non riescono a rispondere agli stimoli esterni.
- Trasferimento L4 larva a seminato Amp / FUDR piatti. Per ogni ceppo o condizione in fase di sperimentazione, è tipico di impostare 2-3 piatti con 25-30 vermi per piastra. Immagini della C. fasi della vita elegans sono forniti per riferimento (Figura 1) 1.
- Luogo Amp / FUDR piastre a 20 ° C per 24 ore.
- Dopo 24 ore, visivamente valutare i vermi, i media, e batteri. Trasferimento a fresco worm Amp / FUDR piastre se uno qualsiasi dei seguenti requisiti:
- I vermi hanno mangiato la maggior parte del cibo batterica. All'inizio i vermi durata della vita esperimento dovrà essere trasferiti 1 a 2 volte la settimana per evitare che i batteri di essere impoverito.
- Un numero significativo di larve sono presenti. Questo di solito è un'indicazione che i vermi sono stati trasferiti al Amp / FUDR piatti come i giovani adulti, invece di L4s e sono stati in grado di porre alcune uova FUDR prima della entrata in vigore. Il FUDR generalmente impedisce alle larve di crescere in adulti a tariffa intera, ma a volte alcuni si svilupperà in adulti e si confondono con gli animali sperimentali.
- Batteri vivi / crescita sono osservate. In generale, la combinazione di Amp e UV-uccisione farà in modo che i batteri non vivono contaminare l'esperimento, ma di tanto in tanto si verifica.
- Crescita fungina si osserva sui media. Se diagnosticato precocemente, la crescita fungina di solito può essere tagliato con l'ausilio di un puntale o spatola. Una volta che cresce fino a essere più grande di pochi millimetri di diametro, di solito è più facile trasferire i vermi a un piatto nuovo.
- Utilizzando la portata dissezione, determinare se ogni worm è vivo o morto.
- Battere delicatamente la piastra. Il worm è vivo se si muove in risposta alle intercettazioni.
- Se il worm non risponde al toccando l', zoom piastra sulla regione della testa.
- Battere delicatamente la testa del verme con pick platino trasferimento. Punteggio ottenuto il worm come morto se non risponde muovendo la testa.
- Vermi morti possono essere rimossi dalla piastra.
- Registrare la data e il numero di worm che sono vivi e morti.
- Ritorna piastre a 20 ° C.
- Ripetere i passi da 3.3 fino a 3,6 ogni 2 o 3 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti.
Parte 4: Risultati Rappresentante.
I dati grezzi prodotti da un esperimento durata nematode la vita è un elenco di date con i numeri corrispondenti di vermi che sono vivi e morti per ogni ceppo testato. Il numero di worm che muoiono ogni giorno è tipicamente invertita per calcolare la percentuale di vermi vivi ogni giorno (Figura 2A), che è tracciata graficamente come una curva di sopravvivenza (Figura 2B, il giorno della deposizione delle uova tempo è considerato giorno 0 ). La durata per ogni singolo verme nello studio possono essere calcolati dal conteggio di vermi che muoiono ogni giorno e utilizzato per calcolare la durata della vita media e mediana per il confronto tra i ceppi. Il conteggio del numero di vermi vivi ogni giorno non viene utilizzato direttamente nell'analisi durata della vita. Worms mantenuta su terreni solidi a volte 'fuga', o strisciare verso l'alto la parete della piastra o giù di sotto della media. Il numero di vermi vivi ogni giorno può essere usato per determinare il numero di worm sono fuggiti in tutto il corso dell'esperimento. Worm che fuggono sono tipicamente rimosso dall'analisi. Come punto di riferimento, la durata della vita media tipica di N2, il C. elegans ceppo selvatico, mantenuti in UV-ucciso i batteri a 20 ° C è di circa 25 giorni, come misurato da un uovo.
Parte 5: Soluzioni
| Nematode crescita Media (NGM), 100 ml: | |
| Combina: | |
| 0,3 g | NaCl |
| 0,25 g | Peptone |
| 2 g | Agar |
| Autoclave per 40 minuti e lasciare raffreddare a 55 ° C, quindi aggiungere: | |
| 100 ul | 1 M MgSO 4 |
| 100 ul | 5 mg / ml colesterolo |
| 100 ul | 1 M CaCl2 |
| 1,625 ml | 1,5 M pH 6,0 Kpi |
| NGM liquido può essere utilizzato immediatamente a versare piatti o lascia solidificare e conservati a lungo termine a temperatura ambiente | |
| Luria Broth (LB), 1L: | |
| 10 g | BactoTryptone |
| 5 g | Estratto di Lievito |
| 10 g | NaCl |
| 10 mL | 1 M Tris pH 8.0 |
| 1 L | acqua deionizzata |
| Autoclave e conservare a temperatura ambiente. | |
| 1 M MgSO 4, 300 ml: | |
| 73,95 g | MgSO 4 |
| 300 mL | acqua deionizzata |
| Autoclave e conservare a temperatura ambiente. | |
| 5 mg / ml colesterolo, 200 ml: | |
| 1 g | colesterolo |
| 200 mL | 100% di etanolo |
| Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente. | |
| 1 M CaCl 2, 500 ml: | |
| 27,75 g | CaCl 2 |
| 500 ml | acqua deionizzata |
| Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente. | |
| KPI 1,5 M pH 6.0, 1L: | |
| Combina: | |
| 31,4 g | Kpi bibasico |
| 179,6 g | Kpi monobasico |
| 850 ml | acqua deionizzata |
| Calore durante la miscelazione per consentire KPI a dissolversi in soluzione. Regolare il pH a 6,0 con NaOH 10 N. | |
| Aggiungere acqua deionizzata a 1 L. | |
| Autoclave e conservare a temperatura ambiente. | |
| 1 M Tris, pH 8.0: | |
| 60,57 g | Tris |
| 400 mL | acqua deionizzata |
| Regolare il pH a 8,0 con HCl. | |
| Aggiungere acqua deionizzata a 500 ml. | |
| Filtro sterilizzare e conservare a temperatura ambiente. | |
| 150 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR), 10 ml: | |
| 0,3693 g | FUDR |
| 10 mL | sterile di acqua deionizzata |
| Conservare a -20 ° C. | |
| 100 mg / ml Ampicillina (Amp), 10 ml: | |
| 1 g | Ampicillina |
| 10 mL | sterile di acqua deionizzata |
| Conservare a -20 ° C. | |
| 50 mg / ml Carbenicillin (CARB), 10 ml: | |
| 500 mg | Carbenicillina |
| 10 mL | sterile di acqua deionizzata |
| Conservare a -20 ° C. | |
| 1 M Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 ml: | |
| 2,38 g | IPTG |
| 10 mL | sterile di acqua deionizzata |
| Conservare a -20 ° C. | |
Immagini campo Figura 1. Brillante di C. fasi della vita elegans, tra cui uova, i quattro stadi larvali (L1 - L4) e adulti. Tutti i pannelli mostrano ermafroditi tranne in basso a destra, che mostra un maschio adulto (immagine da Wood (1988)).
I risultati rappresentativi Figura 2. Dal C. sperimentare la vita elegans durata confrontando ceppo selvatico N2 tipo di un ceppo che contiene una mutazione nel gene daf-2. (A) una tabella che mostra i dati raccolti, incluso il numero di giorni dal worm sono state le uova, il numero di vermi morti osservati ogni giorno, e la percentuale del campione originale rimanendo in vita ogni giorno (come calcolato dai conti ogni giorno di vermi morti) . (B) Sopravvivenza curve corrispondenti ai dati di durata della vita previsto (A).
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Discussion
Il controllo genetico della longevità è stato studiato estensivamente in C. elegans, in gran parte dovuto alla facilità e rapidità con cui durata può essere determinata. Il protocollo descritto in questo articolo descrive un quadro di base per ottenere dati riproducibili durata della vita in C. elegans e può essere applicato anche alle specie relatednematode 2. Facendo alcune modifiche semplici queste procedure possono essere adattati per misurare la durata della vita sotto una varietà di condizioni. Qui si discuterà diverse varianti comuni, tra batteri vivi, RNA interference (RNAi), restrizione dietetica da privazione batteriche, e libera dalla droga NGM.
Probabilmente la variante più comune di questo protocollo è il mantenimento di vermi su batteri vivi. Questo può essere ottenuto facendo alcuni cambiamenti minori. In primo luogo, modificare la procedura di semina delle piastre con batteri (punti 1,7 per 1,13). Invece di crescere OP50 culture alla saturazione, crescere fino a metà-log fase e pipettare 200 ul sulle piastre direttamente dalla cultura liquido. Permettono ai batteri di crescere sui piatti durante la notte e omettere l'esposizione ai raggi UV. Ampicillina dovrebbero essere esclusi anche dalle piastre con FUDR. Un vantaggio di utilizzare batteri vivi è che i worm non devono essere trasferiti come spesso piatti nuovi, perché il cibo batterica è viva e cresce. Lo svantaggio di vivere cibo batterica è che OP50 è patogeno per C. elegans 3. Worms coltivate su batteri vivi hanno una durata più breve dal vivo che i worm coltivate su UV-batteri uccisi, 3, che potrebbero mascherare fenotipi durata della vita associata con l'invecchiamento. Durata mediana di batteri vivi è di circa 20 giorni.
Gene abbattere da RNAi è facilmente realizzabile in C. elegans modificando il loro cibo batterica in modo da produrre l'RNA corrispondente al gene da abbattere a doppio filamento. Due biblioteche RNAi batteriche sono disponibili che coprono oltre il 90% dei telai lettura aperta in C. genoma elegans. 4-9 Per utilizzare RNAi nel contesto di vita, sostituire la OP50 batteri con il clone RNAi di interesse e seguire le modifiche discusse nel paragrafo precedente per la misurazione della durata di batteri vivi. Le librerie RNAi utilizzare un sistema basato plasmide di espressione. Il plasmide è stato selezionato per l'utilizzo di una cassetta di resistenza carbenicillina ed espressione del RNA a doppio filamento è indotta da isopropilico β-d-thiogalactopyranoside (IPTG). Sia carbenicillina e IPTG devono essere inclusi nelle piastre NGM. Modificare passo 1,4 aggiungendo 100 l 1 M IPTG e 50 microlitri 50 mg / ml per 100 carbenicillina NGM mL per entrambi i tipi di piatti. Ampicillina non ha bisogno di essere inserito in entrambi i tipi di piatto, dal momento che carbenicillina svolge lo stesso ruolo.
Restrizione dietetica è l'intervento più ampiamente studiato per rallentare l'invecchiamento tra le specie evolutivamente divergenti. In C. elegans, massima estensione durata di vita su terreni solidi si osserva quando la fonte di cibo dei batteri viene completamente rimosso durante l'età adulta, una forma di restrizione dietetica definito privazione batterica (BD). 9, 10 Per misurare la durata della vita nel contesto di BD, fare due modifiche al protocollo di cui sopra. In primo luogo, preparare un terzo tipo di piatto. Queste piastre devono essere identico al Amp / FUDR piatti tranne manca la fonte batterica degli alimenti. In secondo luogo, modificare la parte 3 per includere un ulteriore passo passo tra 3.2 e punto 3.3. Al 4 ° giorno di età adulta (4 giorni dopo il trasferimento del L4 di Amp / FUDR) trasferimento vermi BD di Amp / FUDR piatti mancano i batteri. Una complicazione associata a questa forma di restrizione dietetica è la tendenza a fuggire i vermi '. In assenza di cibo i vermi non stare vicino al centro del piatto, ma aumenta la loro area di esplorazione in cerca di cibo. Di conseguenza, una parte maggiore dei vermi strisciare le pareti della piastra e di essiccare. Vediamo spesso 50% al 70% degli animali fuggono dopo essere stato trasferito a piastre BD. Per risolvere questo problema, iniziare con tre volte più molti worm al fine di avere un numero significativo rimasti sulle piastre di post-volo. BD può anche essere combinato con cibo vivo batterica senza ulteriori modifiche, o di micro-RNA con una modifica aggiuntiva. Per BD con RNAi, un antibiotico aggiuntive devono essere aggiunti alle piastre senza batteri per evitare che i batteri trasferiti con i vermi di crescere e di fornire una fonte di cibo indesiderata. Due esempi sono la tetraciclina e kanamicina, ciascuno dei quali possono essere aggiunti alle piastre FUDR senza cibo batterica durante il passo 1.4. BD può anche essere avviata già 2 giorni di età adulta o il più tardi 14 giorni di età adulta, senza alcun impatto significativo sulla durata della vita 10.
L'ultima modifica di cui parleremo è misurare la durata della vita su piastre NGM senza farmaci supplementari (per esempio ampicillina o FUDR). Questo può essere realizzatosemplicemente non aggiungendo i farmaci per la NGM durante la fase 4 e aggiungendo un ulteriore passo nella parte 3. Senza FUDR i vermi continuerà le uova e la produzione di larve. Durante la loro fase riproduttiva (circa la prima settimana di maturità) tutti i vermi sperimentali dovranno essere trasferiti in piastre di fresco ogni 2 giorni per separarli dalla loro progenie.
C. elegans sono principalmente ermafroditi con rara presenza di maschi. L'aspettativa di vita è di solito misurato per ermafroditi solo, ma può anche essere misurato per i maschi. Ci sono due sfide connesse con il lavoro con maschio C. elegans. Il primo è l'acquisizione di una grande quantità di vermi di sesso maschile, come ermafrodita autofecondazione produce una piccolissima frazione di prole di sesso maschile (0,1%). 11 Una volta una popolazione contenente vermi maschile è raggiunto, maschio / ermafrodita accoppiamento produce un numero circa uguale di maschi e ermafroditi finché vermi sono mantenuti in presenza di cibo. 12 titoli maschile può essere ordinato presso il Centro di Genetica Caenorhabditis o generate dal visivamente lo screening per i maschi fondazione prodotta da ermafroditi autofecondazione. La seconda sfida è maschio comportamento scavenging. In assenza di alimentari o potenziali compagni (ermafroditi), vermi maschi inserire una modalità di ricerca comportamentale che coinvolge una vasta gamma di movimento. 13 Quando mantenuto su lastre di questo risultato comportamento in una grande frazione del worm in fuga i muri piatto e essiccazione . Il metodo generale per affrontare questa difficoltà è semplicemente quello di iniziare con i maschi basta che un numero considerevole rimangono dopo la maggior parte sono fuggiti.
Oltre alla durata della vita, un comune associate all'età fenotipo è l'accumulo di lipofuscina. Lipofuscina è complesso dei rifiuti cellulari che non possono essere degradati che si accumula nelle cellule con l'età ed è usato come un biomarker dell'invecchiamento in C. elegans. 14, 15 fluorescente lipofuscina e può essere facilmente visualizzati in C. elegans utilizzando il canale DAPI di un microscopio a fluorescenza (Figura 3). Accumulo di lipofuscina possono essere visualizzati in vermi essere segnato per la durata della vita direttamente sulle piastre NGM, permettendo la raccolta di un fenotipo utile secondaria in parallelo con la vita.
Oltre alla durata della vita, il protocollo descritto in questo articolo può essere utilizzato anche per segnare la progressione fenotipica di età-associate paralisi in C. elegans modelli di malattia proteotoxicity. 16 Quando un worm diventa paralizzato diventa in grado di scansionare tutto il piatto, ma può ancora muovere la testa. Un worm è segnato come paralizzato se non riesce a muoversi rispetto al NGM in risposta alla piastra di intercettazioni o sollecitazione con un piccone trasferimento di platino, ma si muove la sua testa. Worm che muoiono di solito mantengono il punteggio paralisi (paralisi o no paralizzato) che sono stati dati durante l'osservazione più recente dal vivo. Importante, anche selvatici tipo C. elegans diventare paralizzato con l'età avanzata. Per questo motivo paralisi è tipicamente non ha segnato per i vermi più vecchio di circa 20 giorni, come al di là di questo punto diventa difficile distinguere tra paralisi causate da invecchiamento normale e la paralisi causata da progressione della malattia proteotoxicity.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una Glenn / AFAR scoperte nel Premio Gerontologia e NIH di Grant 1R01AG031108-01 a MKGS è supportato dal NIH formazione concedere P30AG013280. MK è una Ellison Medical Foundation Scholar Nuove invecchiamento.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Ampicillin | Reagent | MidSci | 0339 | |
| BactoTryptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0123-17-3 (211705) | |
| BactoPeptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| CaCl2 | Reagent | Fisher Scientific | NC9699248 (1332-01) | |
| Carbenicillin | Reagent | Gold Biotechnology | C0109 | |
| Cholesterol | Reagent | Sigma-Aldrich | C75209 | |
| Fluorodeoxyuridine (FUDR) | Reagent | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Gold Biotechnology | I2481C5 | |
| KPi Dibasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087862 (3252-01) | |
| KPi Monobasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087861 (3246-01) | |
| MgSO4 | Reagent | Fisher Scientific | NC9561800 (2500-01) | |
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | S251 | |
| Tris | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) |
References
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