Summary
Cette procédure montre la purification et l'expansion in vitro des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T du sang périphérique entier et leur visualisation en utilisant des tétramères CMH de classe II. Tétramères permettent la visualisation directe des cellules T avec une spécificité antigénique unique et défini CMH de classe II restriction.
Abstract
Complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T par cytométrie en flux. Cette méthode repose sur l'interaction entre le peptide hautement spécifique chargée du CMH et les correspondants récepteur des cellules T. Alors que l'affinité d'un seul CMH / peptide molécule est faible, la réticulation des complexes CMH / peptide avec la streptavidine augmente l'avidité de l'interaction, permettant leur utilisation comme réactifs coloration. En raison de la fréquence relativement faible des lymphocytes T CD4 + (~ 1 300 000 en une seule spécificité) ce test utilise une étape de l'amplification in vitro d'augmenter son seuil de détection. Des cellules mononucléaires sont purifiés à partir du sang périphérique par la sous-couche de Ficoll. Cellules CD4 + sont ensuite séparés par une sélection négative utilisant un cocktail d'anticorps biotinylé et d'anti-biotine billes magnétiques. En utilisant des cellules adhérentes de la fraction de cellules CD4 que cellules présentatrices d'antigènes, cellules T CD4 + sont développées dans les médias par l'ajout d'un peptide antigénique et de l'IL-2. Les cellules sont colorées avec élargi correspondant de classe II tétramère en incubant à 37 ° C pendant une heure et ensuite colorées à l'aide d'anticorps de surface tels que l'anti-CD4, anti-CD3 et anti-CD25. Après marquage, les cellules peuvent être directement analysées par cytométrie en flux. Les cellules positives tétramère se forment généralement une population distincte parmi les CD4 + cellules élargi. Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé. Parce que le niveau de coloration tétramère de fond peut varier, les résultats coloration positive doit toujours être comparée à la coloration des cellules mêmes avec un tétramère pertinent. Multiples variantes de ce test de base sont possibles. Cellules tétramère positifs peuvent être triées pour l'analyse phénotypique d'autres, l'inclusion dans ELISPOT ou de tests de prolifération, ou d'autres épreuves du secondaire. Plusieurs groupes ont également démontré la co-marquage utilisant des tétramères et soit anti-cytokine et anti-FoxP3 anticorps.
Protocol
1. Sang périphérique de cellules mononucléaires (PBMC) isolement
- Obtenir un échantillon de sang - le sang doit être recueilli dans des seringues ou des tubes de sang et d'anti-coagulant par l'héparine (1:50 ratio) pour empêcher la coagulation. Attendez-vous à un rendement d'environ 1 × 10 6 PBMC par ml de sang - environ 40% de ce qui sera CD4 positifs (CD4 +) des cellules T.
- Aliquoter le sang dans 50 ml tubes coniques, 25 ml par tube. Si le sang a séparé, mélanger délicatement avant d'aliquotage de distribuer le plasma
- Ajouter PBS, portant le volume total à 40 ml et sous-couche en dressant 11 ml de Ficoll, en insérant dans le tube de sang, et en enlevant soigneusement la pipette aide de la pipette. Le Ficoll va s'écouler lentement dans le fond du tube. Une fois le niveau a égalisé, lentement retirer la pipette du tube de sang et le jeter.
- Boucher les tubes de sang et se déplacer dans les bidons Aerosolve. Refermez les bidons et centrifuger à 900 g pendant 20 minutes - sans frein. Il est essentiel qu'aucun frein est appliqué à la fin de ce spin comme la force de freinage va perturber la couche de cellules.
- Après le spin, les PBMC devrait former une couche distincte blanc entre le plasma jaune (dessus) et ficoll transparent (ci-dessous). Doucement écumer blanche couche de cellules de sang en utilisant une pipette de transfert et le transfert dans un nouveau tube. Certains plasma et Ficoll peut être établi avec les PBMC, mais il faut éviter l'élaboration de toute la couche de globules rouges. Typiquement deux tubes de sang peuvent être combinés en un seul tube de cellule à cette étape pour augmenter la taille de granules.
- Ajouter PBS, portant le volume total de 50 ml et centrifuger à 500 xg pendant 15 minutes - frein faible en bonbonnes aerosolve.
- Aspirer le liquide à l'aide d'une pipette Pasteur, en prenant soin de ne pas perturber le culot
- Traiter avec le tampon hémolytique en ajoutant 5-6 ml dans chaque tube et mélanger délicatement pour enlever les grumeaux. Incuber pendant pas plus de 5 minutes.
- Ajouter PBS, portant le volume total de 50 ml et centrifuger à 230 xg pendant 10 minutes - frein faible. Bonbonnes Aerosolve ne sont plus nécessaires pour ces rotations plus lentes.
- Laver deux fois: liquide Aspirer à l'aide d'une pipette Pasteur, remplir le tube avec du PBS et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes.
- Préalablement à l'étape de lavage final, retirer une partie aliquote de remise en suspension des cellules, diluer avec du bleu trypan, et compter à l'aide d'un hémocytomètre. Ce nombre de cellules va dicter les volumes de réactifs utilisés dans l'étape de séparation des cellules T.
2. CD4 + T * la séparation des cellules
- Aspirer le liquide et ajouter de tampon cours d'exécution pour porter le volume total de 40 ul par 10 millions de cellules. Habituellement, cela nécessite 30 uL de tampon plus le volume résiduel de granules.
- Transférer ce volume à un tube de 15 ml conique.
- Ajouter cocktail d'anticorps à partir du kit d'isolation CD4 - 10 ul par 10 millions de cellules, le tube de la PAC, et le placer sur la glace pendant 10 minutes
- Retirer le tube de la glace, enlever le bouchon, et ajouter 30 uL de courir tampon par 10 millions de cellules
- Ajouter les billes magnétiques à partir du kit d'isolation CD4 - 20 ul par 10 millions de cellules, le tube de la PAC, et le placer sur la glace pendant 15 minutes
- Ajouter dix volumes de tampon de courir pour se laver et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes.
- Pendant la rotation, mis en place l'aimant et 5 ml tube en polypropylène dans votre espace de travail
- Aspirer le liquide du culot cellulaire, ajouter 2 mL de tampon course et enlever les amas en utilisant une pipette de transfert
- Utilisation de la pipette de transfert même, le transfert des cellules dans le tube de 5 ml et incuber dans l'aimant pendant 15 minutes
- Décanter avec précaution le CD4 + fraction de cellules dans un tube de 15 ml marqués par l'inversion de l'aimant et la vidange tous sauf la dernière goutte
- Ajouter encore 2 ml de tampon de course au tube de 5 ml et retirer de l'aimant
- Rincer délicatement les cellules CD4 sur les côtés du tube et transférer dans un tube de 15 ml a marqué
- Ajouter 2 mL de milieu de cellules T dans chaque tube, enlever aliquotes pour le comptage des cellules et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes.
- Diluer aliquotes de cellules au bleu trypan et compter à l'aide d'un hémocytomètre. Ces globules dictera le nombre de puits utilisés pour l'étape de culture d'expansion.
* Alternativement, des colonnes et des perles de MACS (Miltenyi Biotec), le séparateur de cellules Automacs (Miltenyi Biotec), ou séparateur de cellules Robosep (technologies de cellules souches) peuvent être utilisés selon les instructions du fabricant en place d'étapes de 02.02 à 02.11.
3. Dans la culture in vitro d'extension
- Aspirer le liquide de la CD4 + et de cellules CD4 granulés et, sur la base des numérations cellulaires, ajouter les milieux de culture (généralement 3.000.000 cellules CD4 + par ml et 10 millions de CD4 des cellules par mL fonctionne bien pour la mise en place de la culture). La culture d'expansion nécessite 3 à 5.000.000 de CD4 des cellules par puits et de 2 à 3.000.000 cellules CD4 + par puits dans un volume total de 1 ml de milieux de culture dans une plaque 48 puits de culture. Typiquement, les cellules CD4 + sont la population en limitant
- Si désiré, irradier les cellules CD4 (5000 Rad s). Aliquoter CD4 des cellules dans le nombre approprié de puits sur une plaque 48 puits en ajoutant 300 à 500 uL de chacun. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 heure. Les adhérents de CD4 des cellules serviront cellules présentatrices d'antigènes dans la culture d'expansion.
- Retirer la plaque de l'incubateur.
- Laver les puits en ajoutant 500 ul de milieux frais et délicatement aspiration et refoulement de 12 à 20 fois en utilisant une pipette de transfert et la suppression de tous les liquides. Ce lavage laissera derrière une couche de cellules antigène présentant adhérente.
- Quand le lavage est terminé, ajoutez les médias juste assez pour mouiller le fond de chaque puits (environ 100 uL) - sinon, les cellules adhérentes se dessèchent
- Ajouter 2 à 3.000.000 cellules CD4 + à chaque puits. Si nécessaire, ajouter des supports supplémentaires pour porter le volume total dans chaque puits jusqu'à 1 ml.
- Ajouter le peptide désiré à chaque puits. La concentration typique pour la stimulation est de 10 ug / ml final.
- Placez la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 7 jours.
- Après 7 jours, ajouter 50 ul de Hemogen IL-2 (ou équivalent, tels que IL-2 recombinante, 10 UI / mL) dans chaque puits.
- Sur chaque journée subséquente, de surveiller la croissance des cellules à l'aide d'un microscope. Flux des puits qui ne sont pas encore confluentes en supprimant la moitié des médias, en ajoutant des milieux frais et 50 uL d'IL-2. Fractionner puits confluentes par remise en suspension des cellules, le déplacement de la moitié des cellules d'un puits vide, en ajoutant des milieux frais et 50 uL d'IL-2. Retour aux cellules de l'incubateur.
- Les cellules en expansion sera prête pour tétramère, après 13-15 jours de culture.
4. Visualisation des cellules T par coloration tétramère
- Achat ou assembler tétramères pour correspondre à la combinaison de peptides / CMH qui correspondent aux cellules CD4 + stimulés cellules T (voir la discussion des sources de réactifs tétramère). Tétramères devrait être ~ 0,5 mg / ml solution.
- Retirer la plaque de l'incubateur
- Soigneusement prélever la moitié des médias de chaque puits
- Transférer une aliquote de cellules de chaque puits - typiquement 75 uL, soit environ 50 000 cellules - dans un tube de 5 ml en polystyrène FACS
- Ajouter tétramère - typiquement une ul par 50 uL volume total - et les placer dans 37 ° C incubateur pour 1-2 heures. Il est également conseillé de colorer une seconde portion aliquote de cellules de chaque puits avec un tétramère dépareillés comme contrôle négatif.
- Marquer les cellules avec des anti-CD3, anti-CD4, et des anticorps anti-CD25 en ajoutant 30 à 10 uL de chaque anticorps. Marqueurs d'anticorps supplémentaires ou alternatives peuvent être utilisées. Toutefois, ne pas utiliser des anticorps PE labellisés depuis ce canal doit être réservé pour les tétramères. A cette époque, aussi seule étiquette de couleur ou de contrôle isotype utilisant des cellules supplémentaires.
- Incuber les cellules d'anticorps marqués pendant 15-30 minutes sur la glace ou à 4 ° C.
- Laver chaque tube avec 0,5 à 2 ml de tampon courir et centrifuger à 230 g pendant 10 minutes.
- Soigneusement liquide décanter à partir des tubes FACS. Stockez tous les tubes dans un récipient couvert (de préférence sur la glace) pour l'analyse FACS ultérieures.
5. Acquisition cytomètre de flux et d'analyse
- Calibrer le cytomètre en flux utilisant des billes de référence.
- Vérifiez les paramètres de l'instrument:
- En utilisant des cellules de contrôle non coloré ou contrôle isotype, d'ajuster l'emplacement de la porte de lymphocytes viables (FSC vs SSC). Retirez l'auto-fluorescence de tous les canaux en centrant la population (en changeant les réglages de gain) en dessous de la première décennie sur chaque axe.
- L'utilisation seule des tubes de contrôle des couleurs, des événements au sein du centre de quadrants correcte pour chaque couleur (en changeant les paramètres de compensation).
- Faites un réglage fin des paramètres de l'instrument en utilisant un tube coloré avec une tétramère pertinent. Dans des contextes particuliers pour le canal PE peut nécessiter un ajustement parce tétramères souvent tache plus lumineuse que le contrôle des anticorps. Le tétramère non pertinents doivent tacher <0,5% de la cellules CD4 +.
- Acquérir des données pour chaque tube
- Collecter des événements pour chaque tube d'échantillon et de contrôle négatif
- Acquérir et d'économiser au moins 20 000 événements pour Analysys
- Analyser les données
- Importer des données des fichiers dans des logiciels d'analyse FACS (par exemple CellQuest logiciels, WinMDI ou FlowJo). Commencez votre analyse en utilisant un tube de teint en utilisant un tétramère pertinent.
- Terrain FSC vs SSC et dessiner une porte dans les lymphocytes vivants (figure 1, en haut à gauche).
- Terrain vs CD4 CD3 (gated pour montrer les lymphocytes vivants seulement) et en tirer des barrières autour du CD3 + CD4 + et les populations (figure 1 panneau en haut à droite).
- CD4 Terrain vs tétramère (gated pour montrer lymphocytes CD3 + uniquement) et fixer les limites du quadrant afin que les cellules CD4 + + tétramère population est inférieure à 0,5% (Figure 1 panneau inférieur gauche).
- Plot CD25 vs tétramère (gated pour montrer que les lymphocytes CD4 +) et fixer les limites du quadrant afin que les CD25 + + tétramère population est inférieure à 0,5% (Figure 1 panneau du bas à droite).
- Analyser l'ensemble des tubes d'échantillon sans changer les portes.
1167/JOVE 20FIGURE%% 201.png "alt =" Figure 1 "width =" 600 "height =" 342 "/>
Figure 1. Représentant des résultats négatifs de contrôle tétramère coloration. Le panneau supérieur gauche montre avant diffusion latérale dispersent versets et la porte la taille des lymphocytes (R1). Le panneau supérieur droit est fermé pour la R1 et montre ant-CD4 par rapport aux anti-CD3 et le CD3 + (R2) et CD4 + (R3) portes. Le panneau inférieur gauche est fermée pour R2 et montre anti-CD4 par rapport tétramère. Le panneau en bas à droite est fermée pour R3 et montre anti-CD25 par rapport tétramère. Les quadrants pour les deux parcelles tétramère ont été fixés à 0,5%.
6. Les résultats représentatifs
- Les cellules tétramère positifs devraient être une population distincte parmi les CD4 + élargi cellules (figure 2).
- Cellules tétramère positifs sont généralement CD25 + CD4 et souvent élevé.
- Dans certains cas, une combinaison du CMH / peptide peut donner une coloration de fond (souvent causée par un peptide à faible solubilité). Coloration de fond peuvent être différenciés à partir d'un vrai positif parce que les «faux positifs» les cellules ne sont pas une seule population distincte soit sur le CD4 vs tétramère ou le CD25 vs parcelles tétramère (figure 3).
Figure 2. Représentant des résultats positifs coloration tétramère. L'agencement du panneau et la stratégie de gating sont identiques à la figure 1. Les cellules positives tétramère apparaissent comme une population distincte de CD4 élevé sur l'anti-CD4 par rapport aux panneaux et un tétramère distinctes CD25 + de la population sur l'anti-CD25 par rapport panneau de tétramère.
Figure 3. Représentant "faux positifs" coloration tétramère. L'agencement du panneau et la stratégie de gating sont identiques à la figure 1. Les anti-CD4 par rapport aux panneaux tétramère montre une indistincte "monticule" coloration. L'anti-CD25 par rapport tétramère montre également un "monticule" coloration, sans tendance claire vers l'être CD25 +.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comprendre le rôle des cellules T CD4 + dans l'immunité est fondamentalement important. Toutefois, CD4 + spécifiques de l'antigène des cellules T peut être difficile à détecter et d'isoler à l'aide des méthodes traditionnelles. En revanche, CMH de classe II tétramères permettent la visualisation directe des cellules T CD4 + à la spécificité de l'antigène désiré. Cette vidéo montre l'isolement, la purification et l'amplification in vitro des cellules T CD4 + et leur visualisation ultérieure en utilisant des tétramères. Classe II tétramères sont conjugués protéine fluorescente composée de solubles biotinylées classe II α / β dimères conjugués autour d'un noyau fluorescentes streptavidine marquée (figure 4). Les tétramères utilisé dans cette vidéo ont été produites par le laboratoire de base Teramer à l'Institut de recherche Benaroya utilisant des cultures cellulaires d'insectes (1). Ces tétramères sont préparés comme à 0,5 mg / ml solution et peut être conservé à 4 ° C pendant 6-18 mois. Tétramères doivent jamais être congelés, comme gel-dégel peuvent enlever souligne l'étiquette PE loin du centre streptavidine. Réactifs de classe II coloration peut être obtenue auprès de plusieurs sources (tableau 1) et sont désignés comme des tétramères, "ultimers", et des multimères. Il convient de noter que la procédure de dosage tétramère décrite ici est distincte de la procédure utilisée pour la classe I tétramères. Classe I tétramère coloration est généralement optimale à 4 ° C, tandis que la classe II tétramère coloration nécessite généralement 37 ° C. Classe tétramères je lie plus étroitement aux cellules T que tétramères de classe II en raison de la forte effet coopératif des CD8 par rapport au CD4. Le dosage de tétramère décrite ici est efficace dans la visualisation des cellules T spécifiques d'antigènes étrangers ou soit l'auto, mais la force d'interaction est intrinsèquement plus faible pour les antigènes du soi. Plusieurs variantes de l'essai sont possibles. Par exemple, les cellules CD4 + T peut encore être fractionnés avant la stimulation (populations, par exemple dans la mémoire et naïf), stimulé en utilisant une protéine entière ou d'un peptide piscines (2), ou divers traitements peuvent être ajoutés à différents puits de mesurer leur influence sur l'antigène réponse spécifique. Étant donné que seulement une portion de chaque puits est nécessaire pour l'analyse tétramère, les cellules restantes peuvent colorés avec tétramère pour le tri ou réservés à d'autres fins. La configuration pour chaque expérience individuelle sera dictée à la fois par les caractéristiques de l'échantillon et par la question scientifique posée. À des fins de conception, il est essentiel de connaître le type HLA du donneur de sang, car cela influencera les épitopes utilisés pour l'expansion et dictera le tétramère correspondant qui doit être utilisé. La connaissance de l'état de la maladie ou la vaccination peut également être crucial pour l'interprétation des résultats. Il est important de bien maintenir les cellules pendant l'étape d'amplification, puisque les cellules malsaines peuvent donner des résultats très médiocres. En outre, bon appareil contrôle l'installation, gating et négatifs sont d'une importance vitale pour l'obtention des résultats à haute qualité de la cytométrie de flux.
Figure 4. Schéma du CMH de classe II tétramère. Le noyau rouge représente la molécule de streptavidine-PE. Les extensions vertes et noires représentent le CMH de classe II α / β dimères. Le complexe est rejoint par l'interaction de haute affinité entre la biotine et la streptavidine.
Tableau 1: Différentes sources de réactifs de classe II coloration
| Source tétramère | Type de produit | Adresse Web |
| Beckman Coulter | Tétramères | www.beckman.com |
| NIH tétramère Facilité | Tétramères | www.research.yerkes.emory.edu / tetramer_core |
| Proimmune | Ultimers | www.proimmune.com |
| Benaroya Research Institute | Multimères | www.benaroyaresearch.org |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous remercions Dick Foley et Leigh Kimball pour leur rôle clé dans le tournage et la production vidéo.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | Or equivalent |
| 50 mL conical Tube | equipment | VWR international | 47747-182 | Or equivalent |
| 1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | Hyclone | SH30028.02 | Or equivalent |
| Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
| Pipet Aid XP | equipment | Drummond Scientific | 4-000-101 | Or equivalent |
| 10 mL pipet | equipment | Corning | CLS4492 | Or equivalent |
| Aerosolve Canisters | equipment | Beckman Coulter Inc. | 359481 | with 50 mL inserts |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | Or equivalent |
| Transfer pipets | equipment | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | Or equivalent |
| Pasteur pipets | equipment | VWR international | 14672-200 | Or equivalent |
| Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| Trypan blue | Reagent | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% in PBS |
| Hemocytometer | equipment | VWR international | 15170-208 | |
| 15 mL conical tube | equipment | VWR international | 05-527-90 | Or equivalent |
| Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
| EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| 5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
| Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
| Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
| 500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalge Nunc international | 595-3320 | Or equivalent |
| 48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
| 37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo | MCO-18AIC | Or equivalent |
| 20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
| 5 mL FACS tube | equipment | Falcon BD | 352008 | Polystyrene |
| Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
| Anti-CD3 | Reagent | BD Biosciences | 347344 | Or equivalent |
| Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
| Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
| Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |
References
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens. J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).
