Summary
Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm 2
Abstract
Aile
Protocol
Bölüm 1: RNA cDNA sentezi
- Ambion Amino Allyl MessageAmp II kiti kullanmadan önce, yıkama tamponlar Önerilen miktar,% 100 etanol ekleyin.
- PCR reaksiyonu tüp, T7 oligo (dT) astar toplam RNA ve 1μl 5μg 100ng arasında ekleyin. Nükleaz içermeyen su ile 12μl hacim kazandırın.
- 70 numune inkübe ° C bir termalcycler 10 dk.
- 70 ° C ve santrifüj kısaca RNA örnekleri çıkarın. Buz üzerine yerleştirin.
- 1. Strand Sentez ana karışımı hazırlayın ve oda sıcaklığında tutmak (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) (Tablo 1)
- Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj.
- Her RNA örnek Master Mix 8μl aktarın. 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme karıştırın.
- PCR 2 saat için 42 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj örnekleri kısaca yer ve buz üzerinde. Hemen dsDNA sentez sonraki adıma geçin.
- Buz üzerinde 2. Strand Sentez master miks (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) (Tablo 2) hazırlayın
- Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj.
- Her bir örnek 80μl aktarın ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın.
- PCR 2 saat 16 ° C'de inkübe edin.
- 2 saat inkübasyondan sonra, cDNA temiz-up adım ile devam ya da -20 ° C'de hemen dondurmak
Bölüm 2: Çift zincirli cDNA clean-up
- CDNA Saf buzdolabından çıkarın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında gelmesini sağlar. Tam olarak kullanmadan önce, manyetik cDNA bağlayıcı boncuklar tekrar süspansiyon için şişeyi iyice çalkalayınız.
- 1.5mL tüp ve inkübe 50-60 ° C önceki 2saat inkübasyon sırasında en az 10 dakika içine kısım nükleaz içermeyen su.
- Her bir numune için cDNA Saf 180μl ekleyin ve iyice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın.
- Orbital çalkalayıcı plaka en az 2 dakika boyunca hafifçe sallayarak örneklerini karıştırmak için devam edin.
- Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Yaklaşık 6 dakika boyunca stand plaka bırakın veya karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar.
- Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
- Manyetik stand plaka çıkarın.
- Her iyi 150μl cDNA Yıkama Tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk yıkama tamponu düşük yüzey gerilimi nedeniyle, bu aşamada dağıtmak ETMEYECEKTIR.
- Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın.
- Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
- Manyetik stand plaka çıkarın.
- Yıkama 150μl cDNA Yıkama Tampon ile 2. kez tekrarlayın.
- 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 2 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Overdry değil!
- 18μl her numune için, önceden ısıtılmış nükleaz ücretsiz su ekleyerek boncuk cDNA elute.
- Orbital çalkalayıcı 3 dakika plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor.
- Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak.
- Dikkatlice yıkandı, cDNA (~ 16μl) yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) aktarmak.
- Doğrudan bir sonraki adıma geçin, ya da -20 ° C'de cDNA dondurmak
Bölüm 3: in vitro Transkripsiyon (IVT)
- IVT ana karışımı oda sıcaklığında (Tablo 3) hazırlayın
- Master Mix veya karıştırmak için fiske yavaşça pipet, ve kısaca santrifüj.
- Her bir örnek 24μl ekleyin ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın.
- Bir termalcycler 14 saat için 37 ° C'de inkübe, daha sonra bir sonraki adıma ° C kadar hazır 4 tutun.
Bölüm 4: Arna clean-up IVT sonra
- Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için.
- Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın (Tablo 4) Bu vaktinden önce yapılabilir. Hazırlanan bağlayıcı karışım, oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklanabilir .
- Vorteks ile iyice karıştırın.
- 1.5mL tüp ve en az 10 dakika boyunca 50-60 ° C'de inkübe içine kısım Arna Elüsyon Tampon.
- Arna bağlayıcı karışımı 70μl ekleyinher bir örnek ve aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme iyice karıştırın.
- PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın.
- Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın.
- Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın.
- Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın.
- Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
- Manyetik stand plaka çıkarın.
- Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın.
- Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın.
- Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın.
- Manyetik stand plaka çıkarın.
- Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile 2. kez tekrarlayın.
- 2. yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin!
- Her numune için 40μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir.
- 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor.
- Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş amino alil dahil Arna içerir.
- Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın.
- (Opsiyonel adım) NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinin RNA konsantrasyonu kontrol edin.
- Hemen bir sonraki adıma üzerine devam eder, ya da -80 Arna saklamak ° C
Tablo 1: cDNA 1. Strand Sentez Master Mix
| Reaktif | 1 reaksiyon için Tutarı |
| 10X İlk Strand Tampon | 2 ul |
| dNTP Mix | 4 ul |
| Ribonükleaz İnhibitörü | 1 ul |
| Dizi Komut | 1 ul |
Tablo 2: cDNA 2. Strand Sentez Master Mix
| Reaktif | 1 reaksiyon için Tutarı |
| Nükleazlar ücretsiz su | 63 ul |
| 10X İkinci Strand Tampon | 10 ul |
| dNTP Mix | 4 ul |
| DNA Polimeraz | 2 ul |
| RNaz H | 1 ul |
Tablo 3: IVT Master Mix
| Reaktif | 1 reaksiyon için Tutarı |
| aaUTP çözümü (75 mM) | 2 ul |
| CTP, ATP, GTP mix (25 mM) | 12 ul |
| T7 UTP çözümü (75 mM) | 2 ul |
| T7 10X Reaksiyon Tamponu | 4 ul |
| T7 Enzim Mix | 4 ul |
Tablo 4: Arna Bağlama Mix
| Reaktif | 1 reaksiyon için Tutarı |
| RNA Cilt Boncuk * | 10 ul |
| Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * | 4 ul |
| % 100 izopropanol ** | 6 ul |
| Arna Cilt Tampon Konsantre | 50 ul |
* İlk RNA bağlayıcı boncuk boncuk tabanda çözümü ile karıştırın.
** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik Adımlar
Dizi veri önyargıları gözlenmiştir olarak ikinci bir tur amplifikasyon tavsiye edilmez. (1. ve 2. iplikçik cDNA sentezi, IVT) enzimatik her adım dikkatle Karıştırma her enzimatik adım inkübasyon uygun sıcaklık, iyi amplifikasyon verimi elde etmek için kritik öneme sahiptir. IVT sırasında 2-3 derece bir hava hibridizasyon fırın veya su banyosu hibridizasyon gibi küçük amplifiye ürün verimi önemli ölçüde etkileyebilir bile sapmalar ayarlanabilir ısıtmalı kapak ile PCR cycler tercih edilir.
Uygulama / Önemi
Bu protokol sonucu etiketli RNA gen ekspresyonu yanıtları değerlendirmek için kültür enfekte hücreleri insan, viral veya özel mikroarray'ler melezleşmiştir olabilir. Mikroarray platformları değişir, bu nedenle etiketli prob hibridizasyon karışımının hazırlanması için üreticinin yönergelerini izleyin.
Özel olarak tasarlanmış bir poxvirus dizi 1 kullanarak, genler viral DNA replikasyonu transkript tespiti için gerekli olup olmadığını ya da "erken" ya da "geç" hibridizasyon sinyali zamanlaması dayalı ve genel kategoride sınıflandırmak için başardık. Biz her zaman sınıf genlerin transkripsiyon kesin olarak beklenen fonksiyonel kategoriler (yani, erken, orta ve geç genlerin beklenen) değişimi gözlemledik.
Bu çalışmada kullanılan yöntemler devam ediyor ve erken ya da geç çoğaltma döngüsü transkripsiyonu virüs genleri tahmin etmek mümkün olabilir, ancak transkript beri çift geç / erken organizatörü ile erken ve geç bir yararlanıcı genlerin karşı daha fazla zorluk sadece erken ayırt Geç zaman algılandı. Buna ek olarak, diziye literatürde RNA belirlenen ORF veya yukarı yönde bir ORF gelmiş gibi geç viral genlerin transkripsiyon ile çalıştırmak, dizi belirli bir prob / noktada sinyal etkileyebilir. Fayans dizileri bu sorunu çözmek için çalıştılar, ancak zorlukları hibridizasyon temelli yaklaşımlar 2,3,4 kullanarak transkripsiyon yoluyla çalıştırılan tespit kalır.
Ev Sahibi transkripsiyonel desenler de bu yöntemler kullanılarak tespit edilebilir. Ancak, vaccinia Konak yanıtları inhibe mekanizmaları çeşitli kodlar ve ev sahibi transkripsiyonel yanıtları diğer uyaranlara 5,6,7,8 göre azalabilir. Konak savunmasında yer alan birçok genin ifadesi enfeksiyondan sonra değişmiş olduğundan, konağın immün yanıtları karşı viral genlerin katkısı bu nedenle dikkate alınması gerekir.
Bu yöntemler kullanılarak, tüm viral genlerin transkripsiyonel zamanlama bir harita tespit ve bilinmeyen viral genlerin fonksiyonlarını sorgulamak için kullanılan olabilir. Buna ek olarak, bu yöntemler karmaşık virüs ve ev sahibi arasındaki diyalogu incelemek için kullanılabilir. Bu yöntemler, genel olarak diğer konak-patojen enfeksiyon sistemleri için geçerlidir. Ilgi patojen mRNA'ların polyadenylated yoksa, alternatif yöntemler doğrusal amplifikasyon olmadan, doğrudan toplam RNA etiketlemek için kullanılan olabilir. Hem ev sahibi ve Senkron enfeksiyon sırasında virüs gen ekspresyonu analiz ederek, bu yöntemler bize virüs bulaşmasına karşı konak hücre ortamının yanı sıra bilgisayar karşı savunmasını virüs etkileşim içgörü kazanmak için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
