Summary
HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。 3パート2。
Abstract
家族の
Protocol
パート1：RNAからcDNA合成
- アンビオンアミノアリルMessageAmp IIキットを使用する前に、洗浄バッファーに100％エタノールの推奨量を追加します。
- PCR反応チューブに、100ngの間にT7オリゴ（dT）プライマーのトータルRNAと1μlのの5μgに追加します。ヌクレアーゼフリー水で12μlにボリュームを起動します。
- 70でサンプルをインキュベート℃でサーマルサイクラーで10分間。
- ° Cと遠心簡単に70からRNAサンプルを削除します。氷の上に置きます。
- 第1ストランド合成のマスターミックスを調製し、（エラーをピペッティングするための10％超過付き）、室温でおいてください。（表1）
- ミックスして、手短に遠心して静かにピペットでマスターミックスまたはフリックします。
- 各RNAサンプルにマスターミックスの8μlを転送する。 3〜4回上下にピペッティングして混ぜる。
- サーマルサイクラーで2時間、42℃でインキュベートする。
- 氷上で遠心サンプルの短時間と場所。すぐに二本鎖DNAの合成の次のステップに進みます。
- 氷上で2 回目のストランドの合成マスターミックス（エラーをピペッティングするための10％超過と）。（表2）を準備
- ミックスして、手短に遠心して静かにピペットでマスターミックスまたはフリックします。
- 各サンプルに80μlを移し、軽く3,4回上下にピペッティングして混ぜる。
- サーマルサイクラーで2時間16℃でインキュベートする。
- 2時間のインキュベーションの後、cDNAを、クリーンアップ手順を続行または-20℃で直ちに凍結する
パート2：二本鎖cDNAをクリーンアップ
- 冷蔵庫からcDNAピュアを取り外して、使用前に30分間室温に平衡化することができます。完全に使用前に磁気のcDNA結合ビーズを再懸濁するためにボトルを振る。
- 1.5mlチューブ50〜60℃でインキュベートC前の2時間インキュベーション中に少なくとも10分間に分注しヌクレアーゼフリー水。
- 各サンプルのcDNAの純粋の180μlを追加し、徹底的に上下にピペッティングにより混合する。 96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。
- 静かに少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振とうしてサンプルをミックスし続ける。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。約6分間、または混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 各ウェルに150μLcDNAを洗浄バッファーを追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、洗浄緩衝液の低い表面張力により、このステップで分散されません。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 150μLcDNAを洗浄バッファーで洗浄2回目のタイムを繰り返します。
- 第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカーで2分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。乾燥し過ぎたしないでください！
- 各サンプルに予熱のNuclease - Free Water18μlを加えることによりビーズからcDNAを溶出させる。
- 精力的にオービタルシェーカー上で3分間プレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。
- 磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。
- 慎重に（〜16μl）溶出したcDNAは、新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に移す。
- 次の手順に直接進む、または-20℃にてcDNAを凍結する
パート3：in vitro転写 （IVT）
- 室温でIVTマスターミックスを調製する。（表3）
- 穏やかに混合し、手短に遠心してマスターミックスや映画をピペット。
- 各サンプルに24μl追加し、軽く3,4回上下にピペッティングして混ぜる。
- サーマルサイクラーで14時間、37℃でインキュベートし、その後次のステップのため° Cまでの準備4で保持する。
パート4：aRNAのクリーンアップIVTの後に
- 簡単に渦RNA結合ビーズを使用前であっても混合物を得ること。
- 室温でaRNAの結合ミックスを準備する（表4）これは、事前に行うことができます- 。プリペアド結合ミックスは、最大1週間まで室温で保存することができます。
- ボルテックスでよく混ぜる。
- 少なくとも10分間、50〜60℃で1.5mlチューブとインキュベートに分注しaRNAの溶出バッファー。
- aRNAの結合ミックスの70μlを追加各サンプルにして3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- PCRプレートから96ウェル丸底プレートにサンプルを移す。
- 各サンプルに100％イソプロパノール50μlのを追加し、3,4回上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- やさしく徹底的にサンプルを混ぜるために、少なくとも2分間オービタルシェーカー上でプレートを振る。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。混合物が透明になり、結合ビーズをペレット化されるまで、スタンドにプレートを残す。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 各ウェルに100μlのaRNAの洗浄液を追加し、適度なスピードでオービタルシェーカー上で1分間プレートを振る。ビーズは、完全にこの段階では分散されないことがあります。
- 磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。
- 慎重に磁気ビーズを乱すことなく真空アスピレーターで上清を吸引除去する。また、注意深くピペットで上清を除去し、上清を捨てる。
- 磁気スタンドからプレートを取り外します。
- 100μlのaRNAの洗浄溶液で洗浄2回目のタイムを繰り返します。
- 第2回洗浄した後、最高速度でオービタルシェーカー上で1分間プレートを振とうしてビーズを乾燥させる。サンプルを乾燥し過ぎたしないでください！
- 各サンプルに40μlの予熱aRNAの溶出バッファーを添加することによりビーズからaRNAのを溶出する。
- 精力的に3分間オービタルシェーカー上でプレートを横に振ると、磁性ビーズが十分に分散されている確認してください。されていない場合は、揺れ続ける。
- 磁気ビーズが完全に分散した後、磁気ビーズを捕捉する磁気スタンドにプレートを移動します。上清は、取り込まれたaRNAのがクリーンアップされたアミノアリルが含まれています。
- 慎重に新たなPCRプレート（またはPCRチューブ）に溶出されたaRNAを転送します。
- （オプションの手順）は、光度計分光光度計に1.5μlずつを測定することにより、サンプルのRNAの濃度を確認してください。
- すぐに次のステップに引き続き、または-80 aRNAの℃にて保存してください。
表1：cDNAの第1のストランドの合成マスターミックス
| 試薬 | 1反応量 |
| 10Xファーストストランドバッファー | 2μlの |
| dNTPミックス | 4μlの |
| リボヌクレアーゼ阻害剤 | 1μL |
| 配列スクリプト | 1μL |
表2：cDNAの第2鎖合成のマスターミックス
| 試薬 | 1反応量 |
| ヌクレアーゼフリー水 | 63μlの |
| 10Xセカンドストランドバッファー | 10μlの |
| dNTPミックス | 4μlの |
| DNAポリメラーゼ | 2μlの |
| RNase H活性 | 1μL |
表3：IVTマスターミックス
| 試薬 | 1反応量 |
| aaUTP溶液（75mMの） | 2μlの |
| ATP、CTP、GTPミックス（25 mM）を | 12μlの |
| T7 UTPソリューション（75 mM）を | 2μlの |
| T7 10X反応バッファー | 4μlの |
| T7酵素ミックス | 4μlの |
表4：aRNAのバインディングミックス
| 試薬 | 1反応量 |
| RNA結合ビーズ* | 10μlの |
| ビーズの再懸濁ソリューション* | 4μlの |
| 100％イソプロパノール** | 6μlの |
| aRNAの結合バッファー濃縮液 | 50μlの |
*最初のビーズ懸濁液でRNA結合ビーズをミックス。
**イソプロパノールを追加し、aRNAの結合バッファー濃縮液を添加する前によく混ぜる。
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Discussion
重要なステップ
配列データにバイアスが観察されているとして、増幅の第二ラウンドはお勧めできません。それぞれの酵素のステップのインキュベーションが適切な温度になるように各酵素段階（第1回および第2鎖cDNA合成、IVT）で慎重に混合することは、良好な増幅収量を得るために重要です。さらに偏差を空気のハイブリダイゼーションオーブンまたは水浴のハイブリダイゼーションにIVTの間に2〜3度と小さいが大幅に増幅産物の収量に影響を与える可能性が - 調整可能なフタ付きのPCRサーマルサイクラーが好ましい。
アプリケーション/意義
このプロトコルに起因する標識されたRNAは、培養で感染した細胞に遺伝子発現の応答を評価するために、人間のウイルス、またはカスタムマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。マイクロアレイプラットフォームが異なるため、標識プローブからハイブリダイゼーション混合物の調製のための製造業者の指示に従ってください。
カスタム設計されたポックスウイルスの配列1を使用して 、我々は、ウイルスDNAの複製は、転写産物の検出に必要なされたかどうかを"早期"か"遅い"のハイブリダイゼーションシグナルのタイミングに基づいての一般的なカテゴリに遺伝子を分類することができた。我々は、転写の正確なタイミングに、各時間のクラスでの遺伝子の予想される機能カテゴリ（すなわち、初期の中間と後期遺伝子を期待される）の変動を観察した。
この作業で利用されるメソッドは、早期または複製サイクルの後半で転写、ウイルスの遺伝子を予測することはできますが、デュアル初期/後期プロモーターと転写産物が解消されないとなる可能性があるため初期および後期プロモーターによる遺伝子対の早期のみ区別する多くの困難を持っている遅い時間に検出された。配列にハイブリダイズするRNAは、指定されたORFまたは上流のORFから来ている可能性があるのでさらに、後期ウイルス遺伝子の転写を介して実行には、アレイ上の特定のプローブ/スポットで信号に影響を及ぼす可能性があります。タイル配列はこの問題を解決しようとした、しかし課題は、ハイブリダイゼーションベースの手法2,3,4を用いて転写を介して実行検出に残ります。
ホスト転写パターンも、これらの方法を用いて評価することができる。しかし、ワクシニア、ホストの応答を抑制するためのさまざまなメカニズムをエンコードし、宿主の転写反応は、他の刺激5,6,7,8に比べて短くなる可能性があります。宿主防御に関与する多くの遺伝子の発現は感染後に変更されているため、宿主の免疫応答を打ち消すのウイルス遺伝子の寄与は、したがって、考慮する必要があります。
これらのメソッドを利用して、すべてのウイルス遺伝子の転写タイミングのマップが同定され、未知のウイルス遺伝子の機能を調べるために使用することができます。さらに、これらの方法は、ウイルスと宿主との間の複雑な対話を分析するために利用することができます。これらのメソッドは、他の宿主 - 病原体の感染システムに広く適用可能である。興味のある病原体は、ポリアデニル化mRNAを持っていない場合は、代替法は線形増幅することなく、直接トータルRNAを標識するために使用することができます。同期感染時の両方のホストとウイルスの遺伝子発現を解析することによって、これらのメソッドは、私たちはウイルス感染に対する宿主細胞環境だけでなく、ホストカウンター防御とウイルスの相互作用を把握することができます。
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Acknowledgments
ホワイトヘッド研究所フェローファンド
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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