מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Summary

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

Abstract

הזדקנות היא תהליך ניוונית המאופיינת הידרדרות מתקדמת של רכיבים סלולריים האברונים וכתוצאה מכך התמותה. שמרים ניצני

Protocol

חלק 1: הכן זנים וצלחות לניתוח תוחלת החיים replicative

סעיף זה מתאר את הכנת לוחות YEPD מוצק לשימוש הניסוי תוחלת החיים replicative והכנת בתאי שמרים לניתוח תוחלת החיים.

1. באמצעות טכניקה סטרילי המתאים, להכין צלחות אגר YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, אגר 2%, גלוקוז 2%) אשר ישמשו עבור בתאי שמרים culturing ו לניתוח החיים replicative תוחלת. אתה צריך להכין לפחות 2 צלחות לכל 4-5 זנים להיות מנותח בניסוי תוחלת החיים. פלטות צריכים להיות מוכנים לפחות 2 ימים לפני הניסוי תוחלת החיים להתייבש לפני תחילת assay תוחלת החיים. אם הניסוי לא יחל בתוך 4-5 ימי לשפוך את הצלחות, הם צריכים להיות ממוקם בתוך חממה בקירור עטוף parafilm או פלסטיק כדי למנוע dessication.
2. הסר זני שמרים ממניות קפוא פס עבור מושבות אחת על גבי צלחות אגר YEPD. עד 6 זנים יכול בקלות להיות מפוספס על הצלחת YEPD אותו על ידי חלוקת העוגה לתוך צלחת בצורת פלחי בגודל שווה.
3. דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 2 ימים.
4. הסרת תאים מן החממה תאים תיקון מהמושבה יחיד על צלחת YEPD טריים. שני תיקונים משתי מושבות שונות צריכה להיות שנוצר עבור כל זן. בשלב זה, זנים כדי להיות מנותח צריך להיות מקודד כדי להבטיח את חיי replicative הניסוי תוחלת מתבצעת "עיוורת", שם dissectors אינם יודעים את זהותו של זנים בודדים.
5. דגירה תוקנו, תאים מקודדים ב 30 ° C עד הערב הבא.
6. הסרת תאים תאים קלות תיקון מהמאמץ כל מקודד על צלחות YEPD טריים, אשר תשמש את הצלחות ניסיוני המשמש ניתוח תוחלת החיים replicative. תאים צריכים להיות תוקנו לאורך קו אנכי בצד שמאל של הצלחת YEPD (איור 1). כ 3-5 טלאים לכל צלחת הוא אופטימלי, בהנחה ניתוח תוחלת החיים replicative על 20 תאים כל תיקון. אין צורך (וגם לא רצוי) כדי להעביר מספר גדול של תאים הצלחת YEPD טריים, כמו זה יגרום לתאים לצמוח עבה במהלך הדגירה לילה, אשר עלול להגביל את תוחלת החיים שלהם בעקבות replicative.
7. דגירה צלחות תוקנו טרי לילה על גבי הספסל.

חלק 2: תאים מיקום לניתוח החיים replicative תוחלת.

בחלק זה אנו מתארים כיצד למקם את התאים השמרים על הצלחת ואיך להשיג לתאי הבת בתולה לניתוח החיים replicative תוחלת. מנקודה זו ואילך, צלחות כל צריך להיות parafilmed, למעט כאשר עובר לנתיחה, על מנת למנוע dessication.

1. באמצעות מיקרוסקופ המצויד במנגנון microdissection מתאים שמרים, להעביר כ 50 תאים מהלחץ תוקנו הראשון עמדה על הצלחת דיסטלי לתאי תוקנו. אם בשלב מיקרוסקופ שלך מדורגת, דרגות אלה יכולים לשמש כדי להבטיח התאים יהיה קל למצוא במהלך חזרות עוקבות. ביום Axioscope Zeiss 40, תאים מן המאמץ תוקנו הראשון יכול להיות ממוקם בבית הקואורדינטות x 90 10 ו ערוכים אנכית משם.
2. נקו את המחט של תאים שוב ושוב על ידי נגיעה במשטח אגר, ולאחר מכן ליצור חור אגר על ידי לאלץ את המחט דרך השטח אגר. חור זה ישמש כסמן כדי לכוון אותך על הצלחת במהלך חזרות עוקבות של דיסקציה של התא הסרת בתו. היזהר שלא לקבל תאים שמרים לחור, או שהם יגדלו בצורה המושבה.
3. ממש מעל החור, ליישר אנכית לתוך תאים בודדים שמרים 20 עמדות מחולקת באופן שווה, עם קוטר מחט 1-3 (~ 100 מיקרומטר) בין העמדה כל תא (איור 1). כל כמה תאים, מקום שני תאים סמוכים זה לזה באותה תנוחה בשורה ולא אחד. זה מאפשר יתירות במהלך בחירת תא בתולה בת, אם אחד התאים הועברו נכשל לחלק.
4. בין ^ה 10 ו ^ה 11 עמדות בקו, ליצור סדרה האופקי של 7-8 חורים אגר. זה ישמש כסמן כדי לכוון אותך על הצלחת במהלך חזרות עוקבות של דיסקציה של התא הסרת בתו. היזהר שלא לקבל תאים שמרים החורים, או שהם יגדלו בצורה המושבה.
5. חזור על שלבים 2.1-2.4 עבור תיקון זה על הצלחת, ממשיכים התאים במערך אנכי לאורך ציר זהה. צעד עבור 2.2, מספר חורים שנוצרו צריכה להתאים למספר התיקון (חור אחד עבור התיקון הראשון, שני חורים של השני וכו ').
6. לאחר התאים היו ערוכים על כל תיקון, parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות.
7. חזור על שלבים 2.1-2.6 על כל צלחת בניסוי.

חלק 3: השג בת בתולה תאים לניתוח תוחלת החיים

בסעיף זה אנו יוזמים את תוחלת החיים על ידי ניתוח להבטיח כי כל תא מתחיל כמו בת בתולההתא.

1. הסר את הצלחות מן האינקובטור ולוודא כי רוב התאים ערוכים עברו חלוקת התא. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר חלוקת התא להסתיים, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור.
2. החל התא ערוכים הראשונה, להשתמש במחט לנתק לתאי הבת מן התא על ידי אמו בעדינות הצבת מחט על גבי תאים המצורפת. לפעמים זה מועיל כדי לנצל את הצד של הבסיס מיקרוסקופ בעוד המחט מונח על התאים.
3. הנח את תא הבת מנותקת בקו אנכי, להחליף את תא האם כל התאים בת נוספת להעביר אותם באופן זמני בצד.
4. חזור על שלב 3.2 ו - 3.3 עבור כל אחד תאים מסודרים. אם התא נכשל לחלק, לקחת תא הבת מאחד התאים מיותר ממוקם בשלב 2.3. בסיום, אתה צריך 20 לתאי הבת עבור תיקון כל מיושרים אנכית על צלחת את תוחלת החיים.
5. איסוף כל התאים האם לתאי הבת נוסף לערימה ולהעבירם חזרה לשטח ליד התיקונים ("בית הקברות"). חשוב לשמור על תאים לא רצויים בהרבה מהתאים שעברו ניתוח תוחלת חיים כדי למנוע היווצרות של microcolonies ודלדול של חומרים מזינים המקומית.
6. Parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 2 שעות.
7. חזור על שלבים 3.2-3.6 על כל צלחת בניסוי.

חלק 4: מדידת קיבולת replicative של תאים בודדים

1. הכן את תוחלת החיים גיליונות נתונים. תוחלת החיים של גיליון הנתונים יכול להיות רשת פשוט שבו כל שורה מתאימה לתא אמא הפרט כל עמודה מקבילה לנקודת בגיל (איור 2). לייבל כל גיליון נתונים על פי מספר זנים להיות מנותח.
2. הסר את הצלחות מן האינקובטור ולוודא כי רוב התאים ערוכים עברו לפחות חלוקת התא. אם נדרש זמן נוסף כדי לאפשר חלוקת התא להסתיים, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור.
3. החל התא ערוכים הראשון על הצלחת הראשונה, מבחינה ויזואלית לבחון את התא אמא ובת (ים) ו לקבוע את מספר חלוקות תא שהתרחשו. זה בדרך כלל קל לקבוע כמה תאים הבת לאם הפיק, בהתבסס על תבניות אופייניות של הסדרים התא. רשום את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם במשבצת המתאימה על גיליון תוחלת החיים ציון.
4. השתמש מחט לנתק לתאי הבת מן התא אמא כמתואר בשלב 3.2.
5. לשמר את התא אמא בעמדה שלו בקו אנכי ולעבור לתא הבת (ים) באופן זמני בצד.
6. חזור על שלבים 4.3-4.5 לכל אחד התאים ערוכים.
7. איסוף כל התאים בת זרוקים ולהעביר אותם אל "בית קברות", הממוקם בסמוך טלאים המקורי.
8. Parafilm את הצלחת לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות.
9. חזור על שלבים 4.3-4.8 על כל צלחת בניסוי.
10. חזור על שלבים עד 4.2-4.9 כל התאים אמא הפסיקו להתחלק. כמו גיל האם התאים, את התקדמות מחזור התא הופך איטי יותר וזה יהיה רצוי כדי לדגור על צלחת עבור תקופות זמן ארוכות יותר בין גיל נקודות. פלטות ניתן להציב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

חלק 5: תוצאות נציג.

הנתונים הגולמיים המיוצר על ידי ניסוי תוחלת החיים replicative היא רשימת מספרים המקביל לתאי הבת המיוצר על ידי תא האם בנקודה בגיל זה (איור 2). על ידי סיכום כל שורה של הגיליון את הציון, תוחלת החיים replicative עבור כל תא האם מתקבל. הנתונים עבור תאים אמא של קבוצת הניסוי אותו ניתן ונקווה כדי ליצור עקומת ההישרדות (איור 3A) וכן כדי לבצע חישובים סטטיסטיים, כגון תוחלת החיים כלומר, תוחלת החיים הממוצע, וסטיית התקן. בדיקת אי - פרמטריים, כגון מבחן Wilcoxon דרגה-Sum, ניתן לבצע כדי לקבוע אם הבדלים משמעותיים בתוחלת החיים התגלו בין קבוצות הניסוי. כאשר הניסוי פועל כראוי, עקומת ההישרדות צריך להיות עקבי עם בערך Gompertz-Makeham קינטיקה מראה shap sigmoidal עם תמותה מוקדמת נמוך לאחר ירידה מהירה יחסית הישרדות החוצה השטחת העקום הגילאים מאוחר יותר. רוב wild-type זנים יש תוחלת חיים replicative הערכים בטווח 20-30 הדור, אף מחוץ וריאציה של טווח זה דווחה.

באיור 1. תרשים של צלחת replicative טיפוסי תוחלת החיים. הערב לפני תחילת microdissection של תאים שמרים, 3-5 זנים הם תוקנו קלות לאורך צד אחד של הצלחת על פני השטח של צלחת YEPD (תיבות אדום) בקו אנכי. בעקבות הצמיחה בין לילה, כ -30 תאים בודדים מתוך כל המתח הם מסודרים במאונך לתוך הקו המכיל 20 עמדות. תוחלת החיים analysiזה יבוצע על תאים v בתולה בת המתקבל תאים אלה הראשונית. תאים עודפים microdissection המתקבל במהלך הניסוי (למשל לתאי הבת לא רצויות) ממוקמים "בית הקברות" (סגלגל אפור), הנמצא הרחק מתאי הניסוי על מנת למנוע דלדול מקומי של חומרים מזינים כמו מושבות נוצרים.

איור 2. תוחלת החיים replicative גיליון מספר הנקודות. נתונים גולמיים ניסוי תוחלת החיים replicative מוצג. כל שורה מקבילה תא שמרים בודד האם כל עמודה מקבילה לנקודת גיל. מספר נכנס בתיבה כל את מספר התאים בת המיוצר על ידי תא האם בנקודה בגיל זה. זן כל תווית עם מספר מקודדים כך הפרט לנתח בתאי שמרים אין ידע על זהותם של זנים להיות מנותח. עשרים תאים assayed עבור כל זן.

איור 3. נציג הישרדות עקומות גדילה של ניסוי תוחלת החיים replicative. (א) עקומות הישרדות מתקבלים על ידי זוממים את החלק היחסי של תאים אמא עדיין בחיים כפונקציה של גיל replicative (מספר חלוקות תא. (ב) עקומות גדילה מתקבלים על ידי התוויית המספר הממוצע של לתאי הבת המיוצר על ידי זן מסוים כפונקציה של נקודה הגיל. בדוגמה זו, זן # 2 ארוך ימים אבל הוא איטי הגוברת, כפי שמעידים המדרון הראשונית מופחת של העלילה את הצמיחה.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose