قياس تنسخي سبان الحياة في الخميرة الناشيء.

Summary

في هذا المقال نقدم بروتوكول عام لقياس مدى الحياة تنسخي من الخلايا الأم الخميرة.

Abstract

الشيخوخة هي عملية التنكسية يتميز التدهور التدريجي لمكونات العضيات الخلوية ويؤدي إلى الوفاة. الخميرة في مهدها

Protocol

الجزء 1 : إعداد لوحات لسلالات والتحليل مدى الحياة تنسخي

هذا المقطع يصف إعداد لوحات لYEPD صلبة لاستخدامها في فترة التجربة تنسخي الحياة وإعداد خلايا الخميرة لتحليل مدى الحياة.

1. باستخدام تقنية معقمة المناسبة ، وإعداد لوحات أجار YEPD (1 خلاصة الخميرة ٪ و 2 ٪ bacto - ببتون ، أغار 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪) التي سيتم استخدامها لزراعة خلايا الخميرة والتحليل مدى الحياة تنسخي. يجب عليك إعداد ما لا يقل عن 2 لوحات لكل سلالات 4-5 ليتم تحليلها في الحياة تجربة تمتد. وينبغي إعداد لوحات على الأقل 2 قبل أيام من حياة تمتد التجربة ، وسمح لتجف قبل البدء في فحص مدى الحياة. إذا لن تكون التجربة التي بدأت داخل 4-5 أيام من صب لوحات ، ينبغي وضعها في حاضنة مبردة وملفوفة في parafilm أو البلاستيك لمنع أصاب.
2. إزالة سلالات الخميرة من المخزونات المجمدة ومتواصلة من أجل المستعمرات واحد على لوحات أجار YEPD. يمكن بسهولة حتى 6 سلالات أن يشوبه على لوحة للYEPD نفس التقسيم في لوحة على شكل دائري أسافين الحجم على حد سواء.
3. احتضان الخلايا على 30 درجة مئوية لمدة 2 ايام.
4. إزالة الخلايا من الخلايا الحاضنة والتصحيح من مستعمرة واحدة على صحن YEPD الطازجة. وينبغي أن يكون إنشاء اثنين من بقع اثنين من المستعمرات المختلفة لكل سلالة. في هذا الوقت ، ينبغي ترميز سلالات لتحليلها للتأكد من أداء عمر التجربة تنسخي "العمياء" ، حيث dissectors لا نعرف هوية من السلالات الفردية.
5. مصححة لاحتضان ، وخلايا ترميز عند 30 درجة مئوية حتى مساء اليوم التالي.
6. إزالة الخلايا والخلايا التصحيح طفيفة من كل سلالة ترميز لوحات YEPD العذبة ، والذي سيكون بمثابة لوحات تجريبية تستخدم لتحليل مدى تنسخي الحياة. وينبغي تصحيحها الخلايا على طول الخط العمودي على الجانب الأيسر من لوحة YEPD (الشكل 1). حوالي 3-5 تصحيحات في اللوحة هو الأمثل ، على افتراض تنسخي تحليل مدى الحياة في 20 من كل الخلايا التصحيح. ليس من الضروري (ولا مرغوب فيه) لنقل عدد كبير من الخلايا لوحة للYEPD جديدة ، لأن هذا سوف يسبب الخلايا لتنمو بشكل كثيف خلال الحضانة بين عشية وضحاها ، والتي قد تحد من حياتهم اللاحقة تنسخي تمتد.
7. احتضان لوحات مصححة حديثا بين عشية وضحاها على رأس مقاعد البدلاء.

الجزء 2 : الخلايا المركز للحياة تنسخي التحليل مدى.

في هذا القسم ونحن تصف كيفية وضع خلايا الخميرة على لوحة وكيفية الحصول على خلايا الابنة البكر للحياة تنسخي التحليل مدى. من هذه النقطة ، ينبغي parafilmed جميع لوحات ، إلا عندما تمر التشريح ، وذلك لمنع أصاب.

1. باستخدام المجهر مزودة جهاز microdissection مناسبة للخميرة ، ونقل ما يقرب من 50 سلالة من الخلايا مصححة أولا إلى موقف وحشي على لوحة للخلايا مصححة. إذا كان لديك مجهر مرحلة متدرجة ، ويمكن استخدام هذه تدرجات لضمان الخلايا سوف يكون من السهل العثور خلال التكرار اللاحقة. على Axioscope زايس 40 ، يمكن وضع الخلايا من سلالة مصححة الأولى في إحداثيات 90 × 10 و المحتشدة عموديا من هناك.
2. تنظيف إبرة من الخلايا عن طريق لمس سطح أغار مرارا ، ثم خلق ثقب في آغار من خلال اجبار الإبرة من خلال سطح آغار. وسوف تخدم هذه الحفرة كعلامة لتوجيه لكم على طبق من خلال التكرار اللاحقة تشريح وابنته إزالة الخلايا. يجب الحرص على عدم الحصول على خلايا الخميرة في الحفرة ، أو أنهم سوف تنمو وتشكل مستعمرة.
3. مباشرة فوق الحفرة ، محاذاة عموديا خلايا الخميرة الفردية إلى 20 وظيفة موزعة بالتساوي ، بأقطار الإبرة 1-3 (~ 100 ميكرومتر) بين موقف كل خلية (الشكل 1). كل خلايا قليلة ، مكان خليتين المجاورة لبعضها البعض في نفس الموضع في السطر بدلا من واحدة. وهذا يسمح لابنته البكر التكرار خلال تحديد الخلية ، إذا كان واحد من الخلايا تفشل في نقل الانقسام.
4. بين ^ال 10 و ^ال 11 في مواقف الخط ، إنشاء سلسلة أفقية من 7-8 ثقوب في أجار. هذا سوف يكون بمثابة علامة على توجيه لكم على طبق من خلال التكرار اللاحقة تشريح وابنته إزالة الخلايا. يجب الحرص على عدم الحصول على خلايا الخميرة في الثقوب ، أو أنها سوف تنمو وتشكل مستعمرة.
5. كرر الخطوات من 2،1-2،4 لكل التصحيح على لوحة ، والاستمرار في مجموعة الخلايا عموديا على طول المحور نفسه. عن الخطوة 2.2 ، يجب أن يكون عدد الثقوب خلق تتوافق مع عدد التصحيح (فتحة واحدة لتصحيح الأولى ، فتحتين للمرة الثانية ، الخ.)
6. بمجرد المحتشدة الخلايا لكل التصحيح ، parafilm لوحة واحتضان حتى 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة.
7. كرر الخطوات من 2،1-2،6 عن كل لوحة في التجربة.

الجزء 3 : الحصول على خلايا ابنته البكر لتحليل مدى الحياة

في هذا القسم ونحن الشروع في التحليل مدى الحياة من خلال ضمان أن كل خلية يبدأ بوصفها ابنة البكرالخلية.

1. إزالة لوحات من الحاضنة والتحقق من أن معظم الخلايا التي تم حشدها خضعت لعملية انقسام الخلايا. اذا كانت هناك حاجة لوقت إضافي يسمح ليستكمل انقسام الخلايا ، وعودة لوحة للحاضنة.
2. مع بداية الخلية المحتشدة الأولى ، استخدام إبر لفصل الخلايا الوليدة من الخلية الأم عن طريق وضع الإبرة بلطف على الجزء العلوي من الخلايا المرفقة. ومن المفيد في بعض الأحيان للاستفادة من جانب قاعدة المجهر بينما الإبرة يستريح على الخلايا.
3. مكان الخلية ابنة منفصلة في خط عمودي ، لتحل محل الخلايا الأم وابنتها أية خلايا إضافية ونقلها جانبا مؤقتا.
4. كرر الخطوة 3.2 و 3.3 لكل من الخلايا التي تم حشدها. إذا فشل خلية لتقسيم وأخذ خلية من ابنة واحدة من خلايا زائدة المتمركزة في خطوة 2.3. عند الانتهاء ، يجب أن يكون الخلايا الوليدة 20 لكل التصحيح محاذاة عموديا على لوحة الحياة تمتد.
5. جمع كل من الخلايا الأم وابنتها خارج الخلايا في كومة وتحويلها مرة أخرى إلى منطقة قريبة من البقع ("مقبرة"). فمن المهم للحفاظ على الخلايا غير المرغوب فيها بعيدا عن الخلايا التي تمر التحليل مدى الحياة لمنع تشكيل microcolonies ونضوب المواد المغذية المحلية.
6. Parafilm لوحة واحتضان حتى 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 2 ساعة.
7. كرر الخطوات من 3،2-3،6 عن كل لوحة في التجربة.

الجزء 4 : قياس قدرة تنسخي الخلايا الفردية

1. إعداد كشوف بيانات تمتد الحياة. ويمكن لصحيفة الحياة أن تكون بيانات تمتد شبكة بسيطة حيث كل صف يناظر الخلية الأم الفردية ويتوافق مع كل عمود إلى نقطة في سن (الشكل 2). تسمية كل ورقة البيانات وفقا لعدد من السلالات التي سيتم تحليلها.
2. إزالة لوحات من الحاضنة والتحقق من أن معظم الخلايا التي تم حشدها قد خضعت واحدة على الأقل انقسام الخلايا. اذا كانت هناك حاجة لوقت إضافي يسمح ليستكمل انقسام الخلايا ، وعودة لوحة للحاضنة.
3. مع بداية الخلية الأولى في المحتشدة لوحة الأولى ، نلاحظ بصريا الخلية الأم وابنتها (ق) وتحديد عدد من الانقسامات الخلوية التي وقعت. فمن السهل عادة لتحديد عدد الخلايا ابنة الأم المنتجة ، واستنادا إلى أنماط مميزة للترتيبات الخلية. تسجيل عدد من الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم في الخانة المناسبة على النتيجة ورقة تمتد الحياة.
4. استخدام الإبرة لفصل الخلايا الوليدة من الخلية الأم كما هو موضح في الخطوة 3.2.
5. الإبقاء على الخلايا الأم في موقفها في خط عمودي ونقل خلية ابنة (ق) إلى مؤقتا جانبا.
6. كرر الخطوات من 4،3-4،5 في كل من الخلايا التي تم حشدها.
7. جمع كل من الخلايا الوليدة تجاهل ونقلها إلى "مقبرة" ، وتقع بالقرب من بقع الأصلي.
8. Parafilm لوحة واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات.
9. كرر الخطوات من 4،3-4،8 عن كل لوحة في التجربة.
10. كرر الخطوات حتى 4،2-4،9 كافة الخلايا الأم قد توقفت الانقسام. كما يجب على الأم خلايا السن ، وتقدم دورة الخلية تصبح أبطأ ، وسيكون من المرغوب فيه لاحتضان لوحة لفترات أطول من الوقت بين نقاط العمر. ويمكن وضع لوحات عند 4 درجات مئوية خلال الليل.

الجزء 5 : نتائج الممثل.

البيانات الخام التي تنتجها فترة التجربة تنسخي الحياة عبارة عن أرقام قائمة المناظرة إلى الخلايا الوليدة التي تنتجها كل خلية الأم في كل نقطة في سن (الشكل 2). عن طريق جمع كل صف من لائحة الهدافين ، يتم الحصول على عمر تنسخي لكل خلية الأم. ويمكن تجميع البيانات عن الخلايا الأم من نفس المجموعة التجريبية لتوليد منحنى البقاء على قيد الحياة (الشكل 3A) وإجراء الحسابات الإحصائية ، مثل عمر يعني ، متوسط ​​العمر ، والانحراف المعياري. يمكن إجراء اختبار غير المعلمية مثل اختبار الرتبة مجموع Wilcoxon ، لتحديد ما إذا كان تم الكشف عن اختلافات كبيرة في طول العمر بين المجموعات التجريبية. عند التجربة يعمل بشكل صحيح ، يجب أن تكون متسقة منحنى بقاء تقريبا مع إن السفارة - Makeham حركية تظهر حالات العسر الشديد السيني مع انخفاض الوفيات المبكرة اتبعت الانخفاض السريع نسبيا في البقاء على قيد الحياة والخروج من تسطيح منحنى الأعمار في وقت لاحق. معظم السلالات البرية من نوع لديها قيم تنسخي مدى الحياة في مجموعة الجيل 20-30 ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن الاختلاف من خارج هذا النطاق.

الشكل 1. رسم تخطيطي لوحة تنسخي نموذجية تمتد مدى الحياة. في المساء قبل بداية microdissection من خلايا الخميرة ، ومصححة طفيفة 3-5 سلالات على سطح لوحة YEPD (مربعات حمراء) في خط عمودي على طول جانب واحد من لوحة. في أعقاب نمو بين عشية وضحاها ، وحوالي 30 المحتشدة الخلايا الفردية من كل سلالة عموديا في خط يحتوي على 20 وظيفة. الحياة تمتد analysiسوف يتم تنفيذها على خلايا ت ق ابنته البكر التي تم الحصول عليها من هذه الخلايا الأولية. وتوضع الخلايا الإضافية التي تم الحصول عليها من خلال التجربة microdissection (مثل الخلايا غير المرغوب فيها ابنته) في "مقابر" (بيضاوية اللون الرمادي) ، والذي يقع بعيدا عن الخلايا التجريبية من أجل تجنب نضوب المحلية من المواد الغذائية حيث يتم تشكيل المستعمرات.

الشكل 2. ويرد عمر تنسخي ورقة الفرز. بيانات أولية من فترة التجربة تنسخي الحياة. كل صف يناظر خلية الخميرة الأم واحدة ويقابل كل عمود إلى نقطة العمر. عدد دخلت في كل مربع هو عدد الخلايا الوليدة التي تنتجها الخلايا الأم في تلك المرحلة العمرية. يسمى كل سلالة مع عدد مشفرة مثل أن الفرد تشريح خلايا الخميرة لا يوجد لديه معرفة هوية من السلالات التي يجري تحليلها. ويعاير العشرين الخلايا لكل سلالة.

الشكل 3. بقاء ممثل ومنحنيات النمو من فترة التجربة تنسخي الحياة (A) ويتم الحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة من قبل المتهم بالتآمر في جزء من الخلايا الأم لا تزال على قيد الحياة بوصفها وظيفة من العمر تنسخي (عدد انقسامات الخلية (ب) منحنيات النمو هي التي حصل عليها المتهم بالتآمر في متوسط ​​عدد الخلايا التي تنتجها ابنة سلالة معينة بوصفها وظيفة من نقطة العمر. وفي هذا المثال ، سلالة # 2 هو الأطول عمرا ولكن أبطأ نموا ، كما يتضح من انخفاض المنحدر الأولي للمؤامرة النمو.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Reagent	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Bacto-Peptone	Reagent	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
Yeast Extract	Reagent	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)
Glucose