שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

Summary

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

Abstract

תפוקה גבוהה שיטות לבחון לוקליזציה חלבון או מורפולוגיה אברון הוא כלי יעיל לחקר אינטראקציות חלבון יכול לעזור להשיג הבנה מקיפה של מסלולים מולקולריים. ב cerevisiae Saccharomyces, עם פיתוח של מערך שאינם חיוניים המחיקה גן, אנחנו יכולים ללמוד באופן גלובלי את המורפולוגיה של אברונים שונים כמו reticulum endoplasmic (ER) ו-GFP באמצעות המיטוכונדריה (או גרסה), סמנים רקע גנטי שונה. עם זאת, סמנים GFP שילוב של מוטציה כל אחד בנפרד הוא תהליך עתיר עבודה. כאן אנו מתארים הליך המשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו. באמצעות מערכת רובוטית להתמודד עם צפיפות גבוהה מערכי שמרים מבחר טכניקות סמים, אנחנו יכולים לקצר משמעותית את הזמן הנדרש ולשפר reproducibility. בקיצור, אנחנו חוצים סמן GFP-tagged המיטוכונדריה (Apc1-GFP) למערך צפיפות גבוהה של 4672 מוטציות מחיקה חיוניות הגן על ידי רובוטי העתק מצמיד. באמצעות בחירה דיפלואידי נביטה, נביגה ובחירת סמן כפול, אנו להתאושש גם אללים. כתוצאה מכך, כל מוטציה אחת הפלואידים מכיל Apc1-GFP שולבו ב מוקד הגנומי שלו. כעת, אנו יכולים ללמוד את המורפולוגיה של המיטוכונדריה ברקע שאינם חיוניים כל מוטציה. באמצעות גישה תפוקה גבוהה זו, אנו יכולים ללמוד בנוחות לשרטט את המסלולים ואת גנים המעורבים הירושה לבין היווצרות של האברונים בקביעת הגנום כולו.

Protocol

חומרים ושיטות:

1. זני שמרים:
   • Acp1-GFP (GFP: שלו): בטרמינל C-GFP תיוג של Acp1 נוצר על ידי רקומבינציה הומולוגיים PCR בתיווך באמצעות pKT128 פלסמיד (כולל ה-GFP ו HIS5). Transformants חיובית אושרו על ידי מיקרוסקופיה confocal ואת המושבה PCR. על רקע המתח היה BY7043 (MAT אלפא can1Δ: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) מן בון מעבדה (טונג ובון, 2006).
   • מחיקת מערך Mutant (DMA) (xxx:: KanR): זהו מערך של כ -5,000 מוטציות מחיקה של גנים שאינם חיוניים. כל הגנים האלה חיוניות היו בנוקאאוט על G418. הרקע זן של המערך הוא BY4741 (מאטה his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). DMA שלנו היה במקור בון מעבדה.
2. שילוב Acp1-GFP ב DMA:
   
   פרוטוקול הבאים להכנת מערך ה-GFP מותאמת ניתוח גנטי סינתטי (SGA) טכנולוגיה (טונג ובון, 2006) עם שינויים. כל הצעדים מצמיד העתק נעשים באמצעות הרוטור זינגר צפיפות גבוהה עריכה מערכת רובוטית. לחילופין, הוראות מצמיד או נוזל מבוססי בצפיפות גבוהה רובוט עריכה ניתן להשתמש.
   
   ראשי תיבות: YPD, לחלץ-peptone-דקסטרוז שמרים: SD, סינתטי הנשירה; LRK, Lue / Arg / ליס הנשירה התקשורת; LHRK, Lue / Arg / שלו / ליס הנשירה התקשורת
   
   הכנה
   1. לגדל דשא של Acp1-GFP בתאים על ידי שפיכת 5 מ"ל של התרבות Acp1-GFP לילה לצלחת YPD. אפשר הצלחת לייבש מספיק על ידי אש או עשן במנדף ביולוגי.
   2. דגירה את הצלחת ב 30 ˚ C לילה.
   3. שימוש, רובוט מערך Acp1-GFP זן לתוך 1536 מושבות בכל צלחת. במקביל, להכין עותק חדש של DMA ידי העתק מצמיד את YPD צלחות + G418.
   4. דגירה צלחות ב 30 ˚ C לילה.
      
      הזדווגות ובחירת דיפלואידי
      
      
   5. מטה את המתח Acp1-GFP עם DMA ידי העתק מצמיד ושוב הנחת מושבות על צלחות YPD.
   6. דגירה צלחות ב 30 ˚ C לילה.
   7. Replica-הצלחת מושבות על גבי SD - + G418 שלו הצלחות לבחור תאים דיפלואידי (מאטה / MATalpha).
   8. דגירה צלחות ב 30 ˚ C לילה.
      
      Sporulationg ו נביטה
      
      
   9. Replica-הצלחת דיפלואידי מושבות על התקשורת נביגה משופרת, אשר מכיל רמות נמוכות של מקורות פחמן וחנקן לגרום להיווצרות נבגים meiotic.
   10. דגירה צלחות של 25 ˚ C עבור מינימום של 5 ימים.
   11. לנבוט progenies מאטה meiotic ידי העתק-ציפוי המושבות על LRK מדיה דגירה צלחות ב 30 ˚ C במשך יומיים.
   12. מדיה זו תהיה לגרום נביטה של ​​תאים הפלואידים מ נבגים. מאז פתח LUE2 מסגרת הקריאה (ORF) משולב ב האמרגן STE2 מאטה ספציפית, כל haploids מונבטים יהיה מאטה.
       
       בחירה של שני אללים
       
       
   13. עכשיו זה הכרחי כדי לבחור גם את האלל GFP לבין אלל מוטנטי אחד. כדי להשיג זאת, תאים מאטה הם העתק מצופה על LRK + G418 התקשורת, אשר בוחר עבור תאים הפלואידים שנושאים את המחיקה גן (xxx:: kanR).
   14. דגירה צלחות ב 30 ˚ C לילה.
   15. לבסוף, progenies מאטה meiotic הם העתק מצופה על LHRK + G418 התקשורת כדי לבחור לצמיחה של מוטציות בודדות (xxx:: kanR) גם מחסה Acp1-GFP (GFP: שלו). הצלחות אלה ניתן לאחסן 4 ˚ C עד 3 חודשים.
   
   
   פרוטוקול הבאים להכנת מערך ה-GFP מותאמת ניתוח גנטי סינתטי (SGA) טכנולוגיה (טונג ובון, 2006) עם שינויים. כל הצעדים מצמיד העתק נעשים באמצעות הרוטור זינגר צפיפות גבוהה עריכה מערכת רובוטית. לחילופין, הוראות מצמיד או נוזל מבוססי בצפיפות גבוהה רובוט עריכה ניתן להשתמש.
   
   ראשי תיבות: YPD, לחלץ-peptone-דקסטרוז שמרים: SD, סינתטי הנשירה; LRK, Lue / Arg / ליס הנשירה התקשורת; LHRK, Lue / Arg / שלו / ליס הנשירה התקשורת
   
   הכנה
3. מיקרוסקופית:
   1. בחר את הרצוי מוטציה (ים) להביע Acp1-GFP ישירות מהצלחת.
   2. התאים לגדול בקצב של 30 מעלות צלזיוס YPD או SD - התקשורת שלו בשלב מוקדם יומן.
   3. דמיינו ידי מיקרוסקופיה confocal באמצעות filterset GFP. דוגמה התוצאה הצפויה היא להראות באיור 1.

SGA התקשורת:

התקשורת צמיחה (YPD) מדיה בחירה (SD) משמש פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי בביולוגיה מולקולרית שמרים. נא עיין שיטות שמרים (Amberg et al. 2005) לתיאורים מפורטים.

LRK, LHRK התקשורת (על סך 400 מ"ל)

הוסף על מנת	כמות
שמרים בסיס חנקני עם אמוניום סולפט	2.7 גרם
חומצת אמינולערבב	0.8 גרם
אגר	8 גרם
DH 2 O	360 מ"ל
דוד לחץ
20% דקסטרוז	40 מ"ל
מצננים 65 ˚ C
100 מ"ג / מ"ל ​​canavanine	0.2 מ"ל
100 מ"ג / מ"ל ​​thialysine	0.2 מ"ל
מערבבים, יוצקים 50 מ"ל לכל צלחת

LRK, LHRK + G418 התקשורת (על סך 400 מ"ל)

הוסף על מנת	כמות
שמרים בסיס חנקני ללא אמוניום סולפט	0.7 גרם
תערובת חומצות אמינו	0.8 גרם
מונוסודיום גלוטמט	0.4
אגר	8 גרם
DH 2 O	360 מ"ל
דוד לחץ
20% דקסטרוז	40 מ"ל
מצננים 65 ˚ C
100 מ"ג / מ"ל ​​canavanine	0.2 מ"ל
100 מ"ג / מ"ל ​​thialysine	0.2 מ"ל
200 מ"ג / מ"ל ​​G418	0.4 מ"ל
מערבבים, יוצקים 50 מ"ל לכל צלחת

מועשר נביגה התקשורת (על סך 400 מ"ל)

הוסף על מנת	כמות
אשלגן אצטט	4 גרם
תמצית שמרים	0.4 גרם
דקסטרוז	0.2 גרם
חומצת אמינו נביגה לערבב	0.04 גר '
אגר	8 גרם
DH 2 O	360 מ"ל
דוד לחץ
מצננים 65 ˚ C
200 מ"ג / מ"ל ​​G418	0.4 מ"ל
מערבבים, יוצקים 50 מ"ל לכל צלחת

Discussion

שיטה זו יכולה לעזור ביעילות לשלב סמן המיטוכונדריה, Acp1-GFP לתוך רקע מוטנטים שונים. היא מסתמכת על שימוש במערכת רובוטית, והוא יכול לאמץ בקלות לשימוש עם כל מערכת רובוטית. הליך זה יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של שילוב סמנים. לדוגמה, כדי להמחיש ER, אנו משתמשים באופן שגרתי את הסמן Erg11-GFP. בתמונות נציג שלנו, מוטנטים וסוג בר עם יצרנית Acp1-GFP היו visualiz ed ידי מיקרוסקופיה confocal ללמוד את המורפולוגיה המיטוכונדריה. המוטנטי הראו פנוטיפ המיטוכונדריה שיבשו, ולכן הוא מועמד טוב לחקירה נוספת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SGA media			The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions.