Summary
GFP - 퓨전 단백질은 널리 공촛점 현미경에 의해 organelles을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, organelles의 형태에 영향을 변이에 대한 검사는 일반적으로 개별적인 돌연변이 유발이 필요하며 시간이 소요됩니다. 여기, 우리는 동시에 효모 거의 5000이 아닌 필수적인 유전자에 organelle - GFP 표식을 통합하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
단백질 지방화 또는 organelle의 형태를 검사하기 위해 높은 처리량 방법은 단백질 상호 작용을 공부를위한 효과적인 도구이며 분자 경로의 포괄적인 이해를 얻을 수 있습니다. Saccharomyces의 cerevisiae에서 중요하지 않은 유전자 삭제 배열의 발달과 함께, 우리는 전세계 endoplasmic reticulum (ER)과 mitochondria 사용하여 GFP (또는 변형) - 마커 서로 다른 유전자 배경처럼 다른 organelles의 형태를 공부할 수 있습니다. 그러나, 각 단일 돌연변이에 결합 GFP 표식이 개별적으로 노동 집약적인 과정입니다. 여기, 우리는 정기적으로 저희 연구실에서 사용하는 절차를 설명합니다. 고밀도 효모 배열과 약물 선택 기법을 처리하는 로봇 시스템을 사용함으로써, 우리는 상당히 시간이 필요 단축 및 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 간단한, 우리는 로봇 복제 달아하여 4,672 불필요한 유전자 삭제 돌연변이의 고밀도 배열 GFP - 태그 mitochondrial 마커 (Apc1 - GFP)을 교차. diploid 선택, sporulation, 발아 및 듀얼 마커 선택을 통해, 우리는 두 대립 유전자를 복구합니다. 결과적으로, 각 haploid 단일 돌연변이의 게놈 로커스에서 통합 Apc1 - GFP가 포함되어 있습니다. 이제, 우리는 모두 중요하지 않은 돌연변이 배경으로 mitochondria의 형태를 공부할 수 있습니다. 이 높은 처리량 접근 방식을 사용, 우리는 편리하게 연구와 게놈 전체 설정에서 상속 및 organelles의 형성에 관련된 경로와 유전자를 윤곽을 그리다 수 있습니다.
Protocol
재료 및 방법 :
- 효모 종자 :
- Acp1 - GFP (GFP : : 그의) : Acp1의 C - 말단 GFP - 태그는 플라스미드 pKT128을 (GFP 및 HIS5를 포함)를 사용하여 PCR - 중재 상동 재조합에 의해 생성되었다. 긍정적인 transformants은 공촛점 현미경과 식민지 PCR에 의해 확인되었다. 분 연구소 (통과 분, 2006)에서 : 스트레인 배경 BY7043 (STE2pr - lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 MAT 알파 can1Δ)되었습니다.
- 삭제 돌연변이 어레이 (DMA) (XXX : KanR) : 그것은 중요하지 않은 유전자의 약 5000 삭제 돌연변이의 배열입니다. 이러한 불필요한 유전자의 모든 G418에 기절했다. 배열의 변형 배경은 BY4741 (마타 his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0)입니다. 우리 DMA 원래 분이 연구실에서했다.
- DMA에 Acp1 - GFP를 통합 :
GFP 배열을 만들기위한 다음과 같은 프로토콜은 수정과 합성 유전자 분석 (SGA) 기술 (통과 분, 2006)에서 적응됩니다. 복제 달아 단계의 모든 로봇 시스템을 arraying 싱어 로터 고밀도를 사용하여 수행할 수 있습니다. 또는, 수동 달아 또는 액체 기반의 고밀도 arraying 로봇이 사용할 수 있습니다.
약어 : YPD, 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스, SD, 합성 중퇴, LRK, 루 / ARG /리스 중퇴 미디어, LHRK, 루 / 그 / ARG /리스 중퇴 미디어
준비- YPD 접시에 하룻밤 Acp1 - GFP 문화의 5 ML를 따르고하여 Acp1 - GFP 세포의 잔디를 성장. 접시 불꽃 또는 생물 학적 퓸 후드에서 충분히 건조하도록 허용합니다.
- 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어.
- 판 당 1,536 식민지로 로봇, 배열 Acp1 - GFP의 변형을 사용합니다. 동시에, 복제 YPD + G418 판을 달아하여 DMA의 새로운 사본을 준비합니다.
- 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어.
번식 및 diploid 선택 - 복제 달아 및 YPD 접시에 식민지를 통해 부설하여 DMA와 Acp1 - GFP의 변형을 친구.
- 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어.
- diploid 세포를 (마타 / MATalpha)을 선택 그의 + G418 플레이트 - SD에 복제 판 식민지.
- 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어.
Sporulationg 및 발아 - meiotic 포자의 형성을 유도하기 위해 탄소와 질소 원의 감소 수준을 포함하고 향상된 sporulation 미디어에 복제 판 diploid 식민지.
- 25 ˚ C 오일 최소 번호판을 품어.
- LRK 미디어에 복제 - 도금 식민지로 마타 meiotic progenies를 발아하고 ˚ C 이틀 동안 30 번호판을 품어.
- 이 미디어는 포자에서 haploid 세포의 발아를 유도합니다. LUE2 여는 독서 프레임 (ORF)가 마타 특정 STE2 프로 모터에 통합되어 있기 때문에, germinated 모든 haploids는 마타 것입니다.
두 대립 유전자의 선택 - 이제 GFP의 allele과 단일 돌연변이 allele을 모두 선택하는 것이 필요합니다. 이것을 달성하기 위해, 마타 전지은 복제 도금 유전자 삭제를 (XXX : kanR) 휴대 haploid 세포에 대한 선택 LRK + G418 미디어로.
- 30 ˚ C 하룻밤에 번호판을 품어.
- 마지막으로, 마타 meiotic progenies은 복제 도금 단일 돌연변이의 성장 (XXX : kanR :)에 대한 선택 LHRK + G418 미디어에 또한 Acp1 - GFP 은닉 (GFP를 : 그). 이 번호판은 ˚ C 최대 3 개월까지 4 저장할 수 있습니다.
GFP 배열을 만들기위한 다음과 같은 프로토콜은 수정과 합성 유전자 분석 (SGA) 기술 (통과 분, 2006)에서 적응됩니다. 복제 달아 단계의 모든 로봇 시스템을 arraying 싱어 로터 고밀도를 사용하여 수행할 수 있습니다. 또는, 수동 달아 또는 액체 기반의 고밀도 arraying 로봇이 사용할 수 있습니다.
약어 : YPD, 효모 추출물 - 펩톤 - 덱스 트로 오스, SD, 합성 중퇴, LRK, 루 / ARG /리스 중퇴 미디어, LHRK, 루 / 그 / ARG /리스 중퇴 미디어
준비 - 현미경 :
- 판에서 직접 Acp1 - GFP를 표현 원하는 돌연변이 (들)을 선택하십시오.
- 30 세포를 성장 ° YPD 또는 SD의 C - 초기 로그 단계에 그의 미디어.
- GFP의 filterset를 사용 공촛점 현미경으로 시각화. 예상 결과의 예를 그림 1에 표시됩니다.
SGA 미디어 :
이 프로토콜에 사용되는 성장 미디어 (YPD)와 선택 미디어 (SD)는 정기적으로 효모 분자 생물학에서 사용됩니다. 자세한 설명을 위해 (앰버그 외., 2005) 효모의 방법을 참조하십시오.
LRK, LHRK 미디어 (400 ML의 총)
| 순서에 추가 | 양 |
| 암모늄 황산과 효모 질소베이스 | 2.7 g |
| 아미노산혼합 | 0.8 g |
| 한천 | 8g |
| DH 2 O | 360 ML |
| 압력솥 | |
| 20 % 덱스 트로 오스 | 40 ML |
| 65 쿨 ˚ C | |
| 100 MG / ML canavanine | 0.2 ML |
| 100 MG / ML thialysine | 0.2 ML |
| 믹스, 플레이트 50 ML을 따르다 | |
LRK, LHRK + G418 미디어 (400 ML의 총)
| 순서에 추가 | 양 |
| 암모늄 황산없이 효모 질소베이스 | 0.7 g |
| 아미노산 믹스 | 0.8 g |
| Monosodium 글루 탐 산염 | 0.4 |
| 한천 | 8g |
| DH 2 O | 360 ML |
| 압력솥 | |
| 20 % 덱스 트로 오스 | 40 ML |
| 65 쿨 ˚ C | |
| 100 MG / ML canavanine | 0.2 ML |
| 100 MG / ML thialysine | 0.2 ML |
| 200 MG / ML G418 | 0.4 ML |
| 믹스, 플레이트 50 ML을 따르다 | |
강화 sporulation 미디어 (400 ML의 총)
| 순서에 추가 | 양 |
| 칼륨 아세테이트 | 4g |
| 효모 추출물 | 0.4 g |
| 우선당 | 0.2 g |
| Sporulation 아미노산 믹스 | 0.04 g |
| 한천 | 8g |
| DH 2 O | 360 ML |
| 압력솥 | |
| 65 쿨 ˚ C | |
| 200 MG / ML G418 | 0.4 ML |
| 믹스, 플레이트 50 ML을 따르다 | |
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Discussion
이 방법은 여러 가지 돌연변이 배경에 mitochondrial 마커, Acp1 - GFP를 통합할 효율적으로 도움이 될 수 있습니다. 그것은 로봇 시스템의 사용에 의존하고, 쉽게 어떤 로봇 시스템과 함께 사용하기 위해 채택 수 있습니다. 이 절차는 마커의 다른 유형을 통합 사용할 수 있습니다. 예를 들어, ER을 시각화하기 위해, 우리는 정기적으로 마커 Erg11 - GFP를 사용합니다. 우리의 대표 이미지, 돌연변이 및 Acp1 - GFP 메이커와 야생 유형 visualiz 에드는 mitochondria 형태를 연구하기 위해 공촛점 현미경에 의해했다. 돌연변이 중단 mitochondrial 표현형을 보여, 따라서 자세한 조사를 위해 좋은 후보자이다.
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Acknowledgments
이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (부여 31/C15982), 건강 연구의 캐나다 연구소, 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금에 대한 캐나다 재단 CJR로 건강 연구에 대한 마이클 스미스 재단 (부여에 의해 지원되었다 로웬), 그리고 시력을 위해 싸웠습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
