Summary
GFP संलयन प्रोटीन व्यापक रूप से confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा organelles कल्पना करने के लिए किया जाता है. हालांकि, म्यूटेशनों कि organelles की आकारिकी को प्रभावित करने के लिए स्क्रीनिंग आम तौर पर व्यक्ति mutagenesis की आवश्यकता है और समय लगता है. यहाँ, हम एक विधि के लिए एक साथ खमीर में लगभग +५,००० गैर जरूरी जीन में organelle GFP मार्करों शामिल प्रदर्शित करता है.
Abstract
उच्च throughput प्रोटीन स्थानीयकरण या organelle आकारिकी की जांच के तरीकों प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण है और आणविक रास्ते में से एक व्यापक समझ प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं. Saccharomyces cerevisiae, गैर जरूरी जीन विलोपन सरणी के विकास के साथ, हम विश्व स्तर पर endoplasmic जालिका (ईआर) और mitochondria (या संस्करण) का उपयोग कर GFP-मार्करों अलग जीन पृष्ठभूमि में की तरह अलग organelles की आकारिकी अध्ययन कर सकते हैं. हालांकि, प्रत्येक एकल उत्परिवर्ती में शामिल GFP मार्करों व्यक्तिगत रूप से एक श्रम गहन प्रक्रिया है. यहाँ, हम एक प्रक्रिया है कि नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है का वर्णन. एक रोबोट प्रणाली का उपयोग करने के लिए उच्च घनत्व खमीर arrays और दवा चयन तकनीक संभाल करके, हम काफी छोटा कर सकते हैं और समय की आवश्यकता reproducibility सुधार. संक्षेप में, हम रोबोट प्रतिकृति लगाए द्वारा 4672 nonessential जीन विलोपन म्यूटेंट के एक उच्च घनत्व सरणी GFP टैग mitochondrial मार्कर (Apc1 GFP) के पार. द्विगुणित चयन, sporulation अंकुरण, और दोहरी मार्कर के चयन के माध्यम से, हम दोनों alleles ठीक हो. एक परिणाम के रूप में, प्रत्येक अगुणित एकल उत्परिवर्ती अपने जीनोमिक ठिकाना पर शामिल Apc1 GFP शामिल हैं. अब, हम सभी गैर जरूरी उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में mitochondria की आकारिकी अध्ययन कर सकते हैं. उच्च throughput इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम सुविधा का अध्ययन करने और रास्ते और जीन विरासत में और एक जीनोम चौड़ा सेटिंग में organelles के गठन शामिल चित्रित कर सकते हैं.
Protocol
सामग्री और विधियों:
- खमीर उपभेदों:
- (: उनके GFP): Acp1 GFP - सी टर्मिनल Acp1 GFP-टैगिंग एक पीसीआर की मध्यस्थता मुताबिक़ pKT128 प्लाज्मिड (GFP और HIS5 शामिल हैं) का उपयोग पुनर्संयोजन द्वारा उत्पन्न किया गया था. सकारात्मक transformants confocal माइक्रोस्कोपी और कॉलोनी पीसीआर के द्वारा पुष्टि की गई. बूने प्रयोगशाला (टोंग और बूने, 2006) से: तनाव पृष्ठभूमि BY7043 (STE2pr - lue2 lyp1Δ ura3Δ0 met15Δ0 leu2Δ0 his3Δ1 मेट अल्फा can1Δ) था.
- विलोपन उत्परिवर्ती (डीएमए) सरणी (xxx:: KanR): यह गैर जरूरी जीन का विलोपन के बारे में 5,000 म्यूटेंट की एक सरणी है. इन जीनों के nonessential सभी G418 पर बाहर खटखटाया गया. सरणी के तनाव की पृष्ठभूमि BY4741 (met15_0 his3_1 leu2_0 ura3_0 माता) है. हमारे डीएमए बूने प्रयोगशाला से मूल था.
- डीएमए में Acp1 GFP शामिल:
GFP सरणी बनाने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल सिंथेटिक जेनेटिक (SGA) संशोधनों के साथ विश्लेषण प्रौद्योगिकी (टोंग और बूने, 2006) से अनुकूलित है. प्रतिकृति लगाए चरणों के सभी एक सिंगर उच्च घनत्व रोटर का उपयोग कर रोबोट प्रणाली arraying द्वारा किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, पुस्तिका लगाए या एक तरल आधारित उच्च घनत्व रोबोट arraying इस्तेमाल किया जा सकता है.
Acronyms: YPD, खमीर निकालने peptone - dextrose, एसडी, सिंथेटिक ख़ारिज किया हुआ; LRK, lue / / Arg Lys ख़ारिज किया हुआ मीडिया, LHRK, lue / उनकी / / Arg Lys ख़ारिज किया हुआ मीडिया
तैयार- Acp1 - GFP कोशिकाओं के एक YPD थाली पर रातोंरात Acp1 - GFP संस्कृति का एक 5 मिलीलीटर गिरने से एक लॉन हो जाओ. प्लेट पर्याप्त एक लौ या एक जैविक धूआं हुड में सूखे के लिए अनुमति दें.
- 30 ˚ रातोंरात सी थाली सेते हैं.
- प्लेट प्रति 1536 कालोनियों में एक रोबोट, सरणी Acp1 - GFP तनाव का उपयोग करना. इसी समय, प्रतिकृति YPD + G418 प्लेटों के लिए लगाए डीएमए के एक ताजा प्रतिलिपि तैयार करते हैं.
- 30 ˚ रातोंरात सी प्लेटें सेते हैं.
संभोग और द्विगुणित चयन - प्रतिकृति लगाए और YPD प्लेटों पर कालोनियों पर बिछाने के द्वारा Acp1 GFP डीएमए के साथ तनाव मेट.
- 30 ˚ रातोंरात सी प्लेटें सेते हैं.
- प्रतिकृति प्लेट एसडी पर कालोनियों - उसका + G418 प्लेटें द्विगुणित कोशिकाओं (/ माता MATalpha) का चयन करने के लिए.
- 30 ˚ रातोंरात सी प्लेटें सेते हैं.
Sporulationg और अंकुरण - प्रतिकृति प्लेट बढ़ाया sporulation मीडिया पर द्विगुणित कालोनियों, जो कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों के कम स्तर meiotic spores के गठन प्रेरित होते हैं .
- 25 पर 5 दिनों की एक न्यूनतम के लिए ˚ सी प्लेटें सेते हैं.
- प्रतिकृति - चढ़ाना LRK मीडिया पर कालोनियों द्वारा माता meiotic progenies उगना और पर 30 प्लेटें सेते ˚ सी दो दिनों के लिए.
- यह मीडिया spores से अगुणित कोशिकाओं के अंकुरण को प्रेरित करेगा. के बाद से एक LUE2 खोलने पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) माता - विशिष्ट STE2 प्रमोटर पर एकीकृत है, सभी अंकुरित haploids माता जाएगा.
दोनों alleles की चयन - अब यह दोनों GFP एलील और एक उत्परिवर्ती एलील का चयन करने के लिए आवश्यक है. यह पूरा करने के लिए माता कोशिकाओं प्रतिकृति LRK + G418 मीडिया, जो अगुणित कोशिकाओं है कि जीन विलोपन (xxx:: kanR) ले के लिए चयन पर चढ़ाया.
- 30 ˚ रातोंरात सी प्लेटें सेते हैं.
- अंत में माता meiotic progenies हैं प्रतिकृति मढ़वाया LHRK + G418 मीडिया पर भी Acp1 GFP शरण (GFP: एकल म्यूटेंट (xxx:: kanR) के विकास के लिए चयन करें: उनके) . ये प्लेटें 4 बजे ˚ सी के लिए 3 महीने के लिए लिए भंडारित किया जा सकता है.
GFP सरणी बनाने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल सिंथेटिक जेनेटिक (SGA) संशोधनों के साथ विश्लेषण प्रौद्योगिकी (टोंग और बूने, 2006) से अनुकूलित है. प्रतिकृति लगाए चरणों के सभी एक सिंगर उच्च घनत्व रोटर का उपयोग कर रोबोट प्रणाली arraying द्वारा किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, पुस्तिका लगाए या एक तरल आधारित उच्च घनत्व रोबोट arraying इस्तेमाल किया जा सकता है.
Acronyms: YPD, खमीर निकालने peptone - dextrose, एसडी, सिंथेटिक ख़ारिज किया हुआ; LRK, lue / / Arg Lys ख़ारिज किया हुआ मीडिया, LHRK, lue / उनकी / / Arg Lys ख़ारिज किया हुआ मीडिया
तैयार - माइक्रोस्कोपी:
- वांछित उत्परिवर्ती (ओं) Acp1 GFP थाली से सीधे व्यक्त उठाओ.
- 30 में कोशिकाओं ग्रो ° YPD या एसडी में सी - जल्दी लॉग चरण के लिए उनके मीडिया.
- Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा GFP filterset का उपयोग कल्पना. उम्मीद परिणाम का एक उदाहरण चित्र 1 में शो है.
SGA मीडिया:
विकास (YPD) मीडिया और मीडिया के चयन (एसडी) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नियमित रूप से खमीर आण्विक जीव विज्ञान में प्रयोग किया जाता है. खमीर में विस्तृत विवरण के लिए तरीके के लिए (Amberg एट अल., 2005) का उल्लेख करें .
LRK, LHRK मीडिया (400 मिलीलीटर कुल के लिए)
| क्रम में जोड़ें | मात्रा |
| खमीर अमोनियम सल्फेट के साथ नाइट्रोजन बेस | 2.7 छ |
| एमिनो एसिडमिश्रण | 0.8 छ |
| अग्रवाल | 8 छ |
| DH 2 हे | 360 एमएल |
| आटोक्लेव | |
| 20% Dextrose | 40 मिलीलीटर |
| 65 से अच्छा ° C | |
| 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर canavanine | 0.2 मिलीलीटर |
| 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर thialysine | 0.2 मिलीलीटर |
| मिक्स, प्लेट प्रति 50 मिलीलीटर डालना | |
LRK, LHRK + G418 मीडिया (400 मिलीलीटर कुल के लिए)
| क्रम में जोड़ें | मात्रा |
| अमोनियम सल्फेट के बिना खमीर नाइट्रोजन बेस | 0.7 छ |
| एमिनो एसिड मिश्रण | 0.8 छ |
| मोनोसोडियम ग्लूटामेट | 0.4 |
| अग्रवाल | 8 छ |
| DH 2 हे | 360 एमएल |
| आटोक्लेव | |
| 20% Dextrose | 40 मिलीलीटर |
| 65 से अच्छा ° C | |
| 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर canavanine | 0.2 मिलीलीटर |
| 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर thialysine | 0.2 मिलीलीटर |
| 200 मिलीग्राम / मिलीलीटर G418 | 0.4 मिलीलीटर |
| मिक्स, प्लेट प्रति 50 मिलीलीटर डालना | |
समृद्ध sporulation मीडिया (400 मिलीलीटर कुल के लिए)
| क्रम में जोड़ें | मात्रा |
| पोटेशियम एसीटेट | 4 जी |
| खमीर निकालने | 0.4 छ |
| Dextrose | 0.2 छ |
| Sporulation एमिनो एसिड मिश्रण | 0.04 छ |
| अग्रवाल | 8 छ |
| DH 2 हे | 360 एमएल |
| आटोक्लेव | |
| 65 से अच्छा ° C | |
| 200 मिलीग्राम / मिलीलीटर G418 | 0.4 मिलीलीटर |
| मिक्स, प्लेट प्रति 50 मिलीलीटर डालना | |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस विधि कुशलतापूर्वक मदद से विभिन्न उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि में एक mitochondrial मार्कर, Acp1 - GFP को शामिल कर सकते हैं. यह एक रोबोट प्रणाली के उपयोग पर निर्भर करता है, और आसानी से किसी भी रोबोट प्रणाली के साथ उपयोग के लिए अपनाया जा सकता. यह प्रक्रिया भी मार्करों के अन्य प्रकार के शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ईआर कल्पना के लिए, हम नियमित Erg11 - GFP मार्कर का उपयोग करें. हमारे प्रतिनिधि छवियाँ, एक उत्परिवर्ती और Acp1 - GFP निर्माता के साथ एक जंगली प्रकार में confocal माइक्रोस्कोपी mitochondria आकारिकी अध्ययन के द्वारा visualiz एड थे. उत्परिवर्ती बाधित mitochondrial phenotype दिखाया है, और इसलिए आगे की जांच पड़ताल के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
इस काम में जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद (31/C15982 अनुदान), स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा, कनाडा फाउंडेशन के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड, स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन (CJR के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Loewen), और दृष्टि के लिए लड़ो.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SGA media | The growth media (YPD) and synthetic dropout media (SD) including LRK and LHRK, and enriched sporulation media used in this protocol is routinely used in yeast molecular biology. Please refer to Methods in Yeast (Amberg et al., 2005) for detailed descriptions. |
References
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
- Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).
