Summary
यहाँ हम एक नया Saccharomyces cerevisiae में प्रोटीन परिसरों की पहचान करने के लिए मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स तकनीक का वर्णन. इस अध्ययन में, हम SILAC विधि का इस्तेमाल किया है एक साथ आत्मीयता अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पीछा करने के लिए उच्च विशिष्टता के साथ एक ईआर प्रोटीन, Scs2p के बंधन भागीदारों की पहचान शुद्धि के साथ.
Protocol
सामग्री और तरीके
- खमीर उपभेदों
- सभी उपभेदों BY4742 पृष्ठभूमि पर आधारित इस अध्ययन में इस्तेमाल कर रहे हैं. SILAC नियंत्रण तनाव (Mat एक, his3, leu2, ura3, lys2 और arg4: G418): BY4742 (चटाई अल्फा, arg4 विलोपन तनाव (G418: एक his3, ura3, leu2, और arg4 मैट) संभोग के द्वारा बनाया गया था his3, ura3 leu2 और lys2), और meiotic haploids tetrad विच्छेदन के द्वारा प्राप्त किया गया . इसलिए, नियंत्रण तनाव lysine और arginine के लिए एक auxotroph है. चारा तनाव पीसीआर की मध्यस्थता मुताबिक़ pBS1479 सदिश का उपयोग कर पुनर्संयोजन द्वारा बनाया गया था. इसलिए, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया मिलान टैग मिलकर आत्मीयता शुद्धि (नल) टैग (3) है.
- SILAC:
- SILAC नियंत्रण तनाव कम से कम छोड़ने वालों की 98% एल lysine-4 (0.03 छ / एल, कैम्ब्रिज आइसोटोप) ,4,5,5-D4 और 98% एल arginine-13 सी (6 के साथ पूरक मीडिया में हो गया था .036 छ / एल, कैम्ब्रिज आइसोटोप).
- चारा तनाव नियमित रूप से समृद्ध माध्यम में सामान्य समस्थानिक अमीनो एसिड के साथ हो गया था.
- नल शुद्धि के पहले चरण [इस प्रोटोकॉल कोल्ड स्प्रिंग हार्बर प्रयोगशाला पाठ्यक्रम पुस्तिका (4) से अनुकूलित है]
** अपने शुद्धि, पूर्व ठंडा -80 ° सी फ्रीजर में मोर्टार और मूसल से पहले रात. इसके अलावा, पूर्व ठंड -20 में एक बीकर डिग्री सेल्सियस **
(संस्कृति का 1 एल के लिए) का उपयोग करने से पहले सही इन buffers करें:- 25 μl तस्वीर (1 / 2000), 1M डीटीटी के 50 μl के साथ 30 मिलीलीटर एनपी 40 बफर
- बफर एनपी 40-1 / 200 तस्वीर, 1M डीटीटी के 50 μl साथ 20 मिलीलीटर
- 1 / 2000 तस्वीर के साथ TEV सी के 10 मिलीलीटर बफर, एम 1 डीटीटी के 10 μl
SILAC और तैयारी
- 1L चारा तनाव और नियंत्रण के प्रत्येक के लिए अलग से 600 आयुध डिपो 1.0-1.3 = तनाव हो जाओ.
- 500ml Nalgene अपकेंद्रित्र ट्यूबों में संस्कृति डालो. और 2580X जी पर लोड गोली कोशिकाओं बैलेंस
- छानना मीडिया और 50ml ठंड DH 2 हे के साथ जबकि 50ml अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए कोशिकाओं स्थानांतरित resuspend गोली. गोली कोशिकाओं. ** आप -80 में गोली फ्रीज कर सकते हैं डिग्री सेल्सियस **
- ** ** महत्वपूर्ण सूखी गोली वजन द्वारा 01:01 में चारा तनाव संस्कृति को नियंत्रण तनाव संस्कृति मैच.
- बफर एनपी 40-1 / 2000 / protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल (पीआईसी) के साथ 10ml में प्रत्येक सेल गोली Resuspend.
- सीधे दूसरे के लिए एक ट्यूब decanting के द्वारा दो सेल संस्कृतियों का मिश्रण है.
पिसाई - पूर्व ठंडा मोर्टार में तरल एन 2 डालो और यह पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति देते हैं. परिपत्र गति में मोर्टार कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर जोड़ें. डालो कुछ तरल एन 2 फ्रीज करने के लिए कोशिकाओं. कोशिकाओं पीस जब तक कोशिकाओं को ठीक पाउडर बन जाते हैं. प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक सभी कोशिकाओं जमीन हैं. ** कोशिकाओं पिघलना करने के लिए अनुमति नहीं है. तरल एन 2 जब आवश्यक ** जोड़ें
- पाउडर एक बहुत ठंडा है और कमरे के तापमान पर बीकर पिघलना करने के लिए स्थानांतरण. जब किनारों पिघलना शुरू, 1 / 200 तस्वीर के साथ NP-40 बफर के 20 मिलीलीटर जोड़ें.
- 40 मिलीलीटर Nalgene ट्यूबों कच्चे lysate स्थानांतरण. 39000 xgfor 30 मिनट पर स्पिन.
- जबकि प्रतीक्षा, Sepharose 2B मोती (जीई) के 300 μl ले. एनपी 40 (1 / 2, 000 पीआईसी) बफर 3 बार के 300 μl में मोती धो लें. 300 μl बफर में मोती Resuspend इतना है कि वे 01:01 घोल में हैं.
पूर्व समाशोधन कक्ष lysate - एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और Sepharose 2B मोती जोड़ने. 30 मिनट के लिए ठंडे कमरे में एक rotating मंच पर सेते हैं.
- जबकि इंतज़ार कर रही है, आईजीजी Sepharose 6 मोती (जीई) के 300 μl ले. एनपी 40 (1 / 2, 000 पीआईसी) बफर 3 बार के 300 μl में मोती धो लें. 300 _l बफर में मोती Resuspend इतना है कि वे 01:01 घोल में हैं.
- गोली मोती. सतह पर तैरनेवाला एक नया ट्यूब पर स्थानांतरण. ** पश्चिमी बाद सोख्ता के लिए सहेजें सेल lysate के एक विभाज्य **
आईजीजी sepharose मोती के लिए बाध्यकारी - अपकेंद्रित्र द्वारा Sepharose 2B मोती निकालें. आईजीजी मोती (पहले 1:01 घोल में तैयार) जोड़ें. अधिक कुशल बाइंडिंग के लिए दो नलियों में सामग्री अलग. 2 घंटा के लिए ठंडे कमरे में एक rotating मंच पर सेते हैं.
- नीचे मोती स्पिन. ** अनबाउंड गुट के एक विभाज्य ** सहेजें
- 10 मिलीलीटर बफर एनपी 40 (1 / 2, 000 पीआईसी) के साथ मोती धो लें.
- 3 मिलीलीटर TEV सी बफर (1 / 2, 000 पीआईसी) के साथ मोती धो लें. ** मोतियों की एक विभाज्य सहेजें. यह बाध्यकारी ** की दक्षता को प्रतिबिंबित करेगा
TEV protease दरार द्वारा आईजीजी मोतियों से Eluting - TEV के 1ml - सी (1 / 2, 000 तस्वीर के साथ) बफर AcTEV के 5 μl जोड़ें. मिश्रण के बाद, दो 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में और अधिक कुशल मिश्रण के लिए सामग्री अलग. ठंडे कमरे में एक rotating मंच पर रातोंरात सेते हैं.
- नीचे मोती स्पिन और एक ताजा ट्यूब 1.5 मिलीलीटर eluate हस्तांतरण. TEV सी बफर के अतिरिक्त 0.5 मिलीलीटर के साथ मोती धो
- एक ट्यूब में elaute मिश्रण. आप में कुल eluate के 1.5 मिलीग्राम होना चाहिए.** TEV eluate के एक विभाज्य ** सहेजें
Trichloroacetic एसिड (TCA) precipatation (स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित विश्लेषण द्रव्यमान के लिए, हम EtOH / एसीटेट वर्षण का उपयोग करने की सलाह देते हैं ) - 25 TCA% 100% TCA के साथ aliquots समायोजित करें. ऐसा करने के लिए, 750 μl प्रत्येक के 2 ट्यूबों में 1.5 मिलीलीटर eluate अलग. 100% ट्यूब को TCA के 250 μl जोड़ें. आपका समाधान दूधिया बारी चाहिए.
- आवधिक vortexing के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें.
- अधिकतम गति से 30 मिनट के लिए ठंडे कमरे में टेबल टॉप अपकेंद्रित्र में स्पिन.
- एक बार ठंडा अधिकतम गति (ठंडे कमरे) में 5 मिनट के लिए 0.05 एन एचसीएल और स्पिन युक्त एसीटोन के 500 μl के साथ धोएं.
- ठंडा और अधिकतम (ठंडे कमरे) में 5 मिनट के लिए एसीटोन स्पिन के 500 μl के साथ एक बार धोएं.
- ध्यान से एसीटोन और सूखी गोली को निकालने के.
- चांदी धुंधला के लिए, 1X एसडीएस नमूना बफर के 50 μl में गोली resuspend.
EtOH / एसीटेट precipatation - ग्लाइकोजन के 20 μg जोड़ें
- 100% EtOH के साथ 5X नमूने पतला और एक 2.5 एम शेयर, पीएच 5.0 के साथ 50 मिमी नच 3 सीओओ को समायोजित
- 2hr के लिए समाधान खड़े हो जाओ
- गोली +१२,००० एक्स छ पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर centrifugation द्वारा प्रोटीन उपजी.
एनपी 40-बफर (200 मिलीलीटर के लिए)
| शेयर एकाग्रता | जोड़ना | |
| 10 मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर (7.2 पीएच) | 0.1 एम | 20 मिली |
| 150 मिमी NaCl | 2 एम | 15 मिलीलीटर |
| 1 एनपी 40% | 100% | 2 मिलीलीटर |
| 50 मिमी NAF | एम 1 | 10 मिलीलीटर |
| 0.1 मिमी ना 3 4 VO | 10 मिमी | 2 मिलीलीटर |
| 200 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम | ||
उपयोग करने से पहले जोड़ें:
- 1 / 1, 000 1 एम डीटीटी के
- 1 / 2, तस्वीर के 000 (protease inhibitors कॉकटेल)
TEV सी बफर (50 मिलीलीटर के लिए)
| शेयर एकाग्रता | जोड़ना | |
| 25 मिमी Tris (8.0 पीएच) | 100 मिमी | 12.5 मिलीलीटर |
| 150 मिमी NaCl | 2 एम | 3.75 मिलीलीटर |
| 0.1% एनपी 40 | 100% | 50 _l |
| 0.5 मिमी EDTA | 500 मिमी | 50 __l |
| 50 मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम | ||
उपयोग करने से पहले जोड़ें:
- 1 / 1, 000 1M डीटीटी
- 1 / 2, तस्वीर के 000
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Discussion
शुद्धि की प्रक्रिया के दौरान बचाया aliquots (1) पूर्व मंजूरी दे दी सेल lysate, (2) बाध्य अंश, (3) अनबाउंड अंश, और (4) eluted अंश शामिल करना चाहिए. हम पश्चिमी द्वारा ऊपर aliquots के प्रोटीन सामग्री का विश्लेषण विरोधी नल एंटीबॉडी या चांदी धुंधला का उपयोग करने के लिए प्रयोग के बंधन और eluting दक्षता को प्रतिबिंबित सोख्ता की सलाह देते हैं. एक रजत दाग जेल और एक दाग के उदाहरण चित्र 1 में दिखाया जाता है.
चूंकि SILAC प्रोटीन बाध्यकारी भागीदारों की निष्पक्ष और मात्रा निर्धारित माप के साथ हमें प्रदान करता है, हम केवल नल शुद्धि के पहले चरण का नमूना नुकसान को कम करने के लिए. यदि आप unspecific बंधन के महत्वपूर्ण मात्रा में अनुभव, तुम बाहर ले पूरे प्रोटोकॉल, जो कोल्ड स्प्रिंग हार्बर पुस्तिका (4) में पाया जा सकता है है इच्छा हो सकती है.
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References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 Forthcoming.
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 Forthcoming.
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 Forthcoming.
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 123-125 Forthcoming.
