Summary
عدسة التنمية تنطوي على تفاعلات مع الأنسجة الأخرى. وتتميز العديد من المسوخ الزرد العين عن طريق عدسة صغيرة الحجم بصورة غير طبيعية. هنا نظهر تجربة زرع عدسة لتحديد ما إذا كان هذا النمط الظاهري هو نتيجة لأسباب ذاتية أو تفاعلات مع الأنسجة التالفة التي تحيط العدسة.
Abstract
عدسة يلعب دورا هاما في تطوير الكأس البصرية [1،2]. باستخدام الزرد باعتباره النموذج الحي ، ويمكن تناول المسائل المتعلقة بالتنمية العدسة. والزرد مفيد للدراسات الجينية نظرا لخصائص مفيدة عدة ، بما في ذلك صغر الحجم ، وخصوبة عالية ، ودورة حياة قصيرة ، وسهولة العناية. عدسة التنمية يحدث بسرعة في الزرد. بنسبة 72 HPF ، العدسة الزرد ناضجة وظيفيا [3]. وفرة الموارد الوراثية والجزيئية المتاحة لدعم البحوث في الزرد. بالإضافة إلى ذلك ، التشابه في العين الزرد لتلك الفقاريات الأخرى يوفر أساسا لاستخدامه نموذجا ممتازا للحيوانات عيوب الإنسان [4-7]. المسوخ الزرد يحمل عدة تشوهات العدسة ، بما في ذلك مستويات عالية من موت الخلايا ، والتي في بعض الحالات يؤدي إلى انحطاط كامل للأنسجة عدسة [8].
لتحديد ما إذا كان الشذوذ العدسة هي نتيجة لأسباب ذاتية أو لخلل التفاعل مع الأنسجة المحيطة بها ، ويتم تنفيذ زرع عدسة داخل العين متحولة من النوع البري. يتم تشريح بعناية الإبر المعدنية باستخدام النار مصقول ، والعدسات متحولة أو البرية نوع من الحيوانات المانحة ، وتحويلها إلى المضيف. لتمييز الأنسجة من النوع البري ومتحولة ، يتم استخدام خط المعدلة وراثيا والجهة المانحة. هذا الخط يعبر عن غشاء محدد GFP في جميع الأنسجة ، بما في ذلك العدسة. زرع هذه التقنية أداة أساسية في دراسات المسوخ عدسة الزرد.
Protocol
الجزء 1 : تحضير الأجنة
في هذا البروتوكول ، وسوف نستخدم الرمز للدلالة ي ي س ص عدسة الزرد افتراضية متحولة.
- تتم المحافظة على السلالات الزرد في ظروف معيشية سيئة في منشأة الأسماك 28.5 C على دورة light/10h 14h الظلام.
- في المساء ، مكان الذكور والإناث من سلالة ي ي س ص الزرد : أب / TU ؛ TG (mGFP) في دبابة مع مقسم لفصلها عن بعضها البعض. وعلى سلالة هذا الصليب تعبر عن التحوير GFP في كل أنسجة الجسم ، وسوف تستخدم الجهات المانحة. في موازاة ذلك ، استخدام نفس الإجراء لإنشاء تقاطعات بين الحيوانات البرية من نوع غير المعدلة وراثيا. اعتمادا على الغرض من هذه التجربة ، يمكن للمرء عبر الحيوانات البرية من نوع ي ي س ص في موضع والجهات المانحة أو المضيفين.
- في غضون ساعة واحدة بعد يتحول الضوء على في الصباح ، وإزالة فواصل للسماح للأسماك لزميله.
- بعد 15-30 دقيقة جمع الأجنة في 100 × 15 ملم أطباق بتري ، تنظيفها ، وتغيير المتوسطة (الماء البيض).
- الحفاظ على الأجنة في الحاضنة حتى 28.5 C الوقت المطلوب.
- عندما تصبح جاهزة للزرع ، وإزالة المشيماء يدويا مع اثنين من أزواج من الملقط حادة ، واحتضان الجنين في EDTA 0.2 ٪ في ZFR بالكالسيوم مجانا لمدة 30 دقيقة.
الجزء 2 : إعداد الإبر تشريح
- الإجراء يتطلب زرع نوعين من الإبر : واحد شحذ ، والذي يستخدم لقطع الأنسجة المحيطة العدسة ، إزالة المشيماء ، والإفراج عن agarose الأجنة ، وإبرة حادة تستخدم لتحريك العدسة المانحة وأدخله في المضيف. هنا فإننا سوف تظهر لك كيفية جعل هذه الإبر.
- أولا ، لا بد من قطع رأس ماصة باستير قبالة باستخدام سكين الماس. ثم إدراج كوب الشعرية في تلميح ماصة باستير بحيث حوالي نصف طوله داخله. وهذا سيجعل من السهل على شل سلك التنغستن ذوبان ذلك في الزجاج في الخطوة التالية.
- ثم أدخل سلك التنغستن رقيقة في النهاية المفتوحة من الشعيرات الدموية. صهر الزجاج عبر السلك مع ناسخ بنسن. باستخدام الملقط ، ثابتا في نهاية الزجاج مع الأسلاك المعدنية الملتوية في حين على الطرف الآخر من الإبرة بيدك. ينبغي للزجاج خففت دوامة حول هذا المعدن الذي يعصف في مكانه.
- إذا كنت ترغب بجعل طرف إبرة حادة ، ثم وهذا هو الغاية من الإجراء. لإنشاء شحذ الإبرة ، وعقد أكثر من سلك التنغستن ناسخ بنسن 1-1،5 لدقائق ، وحرق المعدن بحيث يتم إنشاء تلميح جيد جدا. التحقق من جودة غيض من قبل microscropy.It هو فكرة جيدة لتعقيم الإبر في كلا الشعلة لبضع ثوان على الفور قبل الزرع.
الجزء 3 : إعداد الكواشف
- الكالسيوم الخالية من اسماك الزرد رينغر (ZFR) حلول (116 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 2.9 ملي بوكل ، 5 HEPES ملم ، ودرجة الحموضة 7.2)
- 0.2 ٪ EDTA في الكالسيوم الخالية من حلول اسماك الزرد رينغر (الرقم الهيدروجيني 7.2)
- 1.2 agarose ٪ (انخفاض درجة انصهار) في ZFR بالكالسيوم مجانا
- 0.2 agarose ٪ (انخفاض درجة انصهار) في ZFR بالكالسيوم مجانا
- متوسطة جنين (الرقم الهيدروجيني 7.0 ، للتر الواحد يحتوي على : 10 مل محلول هانكس # 1 ، 1ml هانكس الحل # 2 ، 10ML هانكس الحل # 4 ، 10ML هانكس الحل # 5 ، بيكربونات الصوديوم 0.35 غ ، 300 UL من حمض الهيدروكلوريك 2M ، البنسلين الستربتوميسين 500000 U) كما جاء في كتاب اسماك الزرد (مطبعة جامعة ولاية أوريغون ، 2000).
- سلك التنغستن ومطلية بالذهب ، وقطره 0.1mm ، Aesar الفا
- أنبوب شعري ، وقطره 1.0mm ، الآلات الدقيقة العالم
الجزء 4 : زرع الداخلي
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب من البلاستيك ، وإعداد منخفضة بنسبة 1.2 ٪ نقطة ذوبان agarose في ZFR بالكالسيوم مجانا مسخن الى 40 درجة مئوية في حمام مائي.
- المطلوب في هذه المرحلة (30 HPF ، على سبيل المثال) ، بتناول الأجنة في ماصة باستور ، وطرد منها ببطء في أنبوب الطرد المركزي ، وطرد منها ببطء في أنبوب الطرد المركزي ، واحتضان لمدة 5 ثوان تقريبا. وينبغي المحتضنة للمانحين والمضيفين بشكل منفصل.
- مع ماصة ، تناول الأجنة في agarose 1.2 ٪ من أنبوب الطرد المركزي وترتيبها في صفين موازية في طبق بتري البوليسترين 100mm ، مع المضيفين والمانحين منفصلة. بواسطة pipetting بها ببطء وبعناية ، فإن معظم الأجنة الاستلقاء على جنوبهم في agarose. سوف تحتاج إلى إعادة توجيه تلك التي لا تكمن في هذا الموقف باستخدام إبرة حادة بحيث العين قبل مواجهة agarose يتصلب.
- انتظر agarose 1.2 ٪ إلى ترسيخ ثم تراكب مع 0.2 ٪ حل انصهار منخفضة agarose نقطة.
- باستخدام إبرة أشد حدة ، وإزالة أي agarose حول العينين ، وبحرص شديد قطع عدسة الخروج من المضيفة والمانحة باستخدام أجنة السكتات الدماغية الصغيرة. تأكد من مجرد قطع قريبة بما فيه الكفاية لعدسة بحيث لا المسيل للدموع ، ولكن ذلك أيضا لم تقم بإزالة الكثير من الأنسجة بقية العين المضيف.
- مرة واحدة مجانا ، وسوف تطفو العدسات في المتوسط. باستخدام إبرة حادة ، ودفع بعناية المانحةعدسة للتو فوق موقع حيث سيتم استضافة العدسة عادة ، ودفع بعد ذلك الى اسفل العين مع إبرة حادة. قد يكون تجاهل عدسة المضيف.
- ترك المانحة والمضيفة الأجنة في agarose 1.2 ٪ عن 30-60 دقيقة ، ثم حرر عليها من agarose باستخدام إبرة حادة ، ونقلها إلى لوحة 24 - المتوسطة بشكل جيد مع الجنين. يجب على كل احتلال بئر جنين منفصل. تأكد من تسمية الآبار بشكل صحيح بحيث يتضح المضيف الذي يطابق التي المانحة.
- في احتضان 28.5 جيم ويمكن تمييز المانحة المستمدة من العدسة عدسة المضيف على الجانب unoperated من نفس الحيوان على أساس مضان GFP. ويمكن أيضا أن تكون المقاطع التي لقياس حجم العدسة وتحديد ما إذا كان يميز بشكل صحيح.
التين. 1 صورة تضخم منخفض إبرة شحذ تستخدم لزرع العدسات. يتم إدخال الزجاج الشعرية (B) في ماصة باستير (A) ، ويتم إدخال سلك التنغستن رقيقة (C) في نهاية مفتوحة من الشعيرات الدموية. وخفف من الزجاج عبر السلك مع ناسخ بنسن. باستخدام الملقط ، ثابتا في نهاية الزجاج مع السلك المعدني بينما التواء في الطرف الآخر من ماصة باستور مع يدك. ينبغي للزجاج خففت دوامة حول هذا المعدن ، قابضا في مكانه.
التين. (2) نصائح من نوعين من الإبر المستخدمة لزراعة العدسة.
التين. وخضع 3 زرع الأجنة في عدسة 30hpf. وأظهرت جنين المانحة (A ، B) ، والعين مع المضيف على العدسة المزروعة (C ، D) ، والجانب مراقبة الجنين المضيف (E ، F). ويظهر في كل عين كل من الضوء والإضاءة فوق البنفسجية المنقولة كما هو محدد. وقد اتخذت صورا في 48 HPF. تم استخدام Q01 [9] خط المعدلة وراثيا في هذه التجربة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عدة خطوات تتطلب اهتماما خاصا خلال زرع عدسة.
- شحذ الإبر : إنه من الأفضل أن تعد الإبر عدة قبل تنفيذ زرع العدسة ، وغيض من الإبر ينبغي أن تكون رقيقة قدر الإمكان. وهناك أكثر سمكا إبرة المسيل للدموع الأنسجة بسبب قطرها على نطاق واسع ، مما أدى إلى الفشل في العين للشفاء.
- ترتيب الأجنة : الحق قبل الزرع يجب وضع الأجنة لذلك هم على جنوبهم. عند تحديد المواقع ، ويمكن للagarose 1.2 ٪ تتصلب بسرعة كبيرة. لإبطاء تصلب agarose ، يمكن محمى طبق بيتري قبل السماح لها تطفو في المياه 40 درجة مئوية حمام.
- قبل إدخال العدسة داخل العين المانحة المضيف ، في محاولة لإزالة agarose بقدر حول الرأس المضيف ممكن. انه من الاسهل لادخال العدسة المانحة بهذه الطريقة.
- وينبغي بعد زرع عدسة يمكن ترك جزءا لا يتجزأ من الأجنة في طبقة agarose 1.2 ٪ التي تغطيها طبقة agarose 0.2 ٪. وأضاف ان متوسط الجنين مع المضادات الحيوية تساعد في التئام الجروح في كل من الجهات المانحة والمضيفة الأجنة. انتظر 30-60 دقيقة قبل اطلاق أجنة من agarose ، ومن ثم نقلهم الى 24 لوحة متوسطة جيدا مع الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
يتبع هذا الإجراء إلى حد كبير على تقنية زرع المتقدمة للأسماك الكهف من قبل مختبر جيفري بيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
- Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
- Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
- Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
- Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
- Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).
