Summary
העדשה כוללת פיתוח אינטראקציות עם רקמות אחרות. מספר מוטציות עין דג הזברה מתאפיינים בגודל העדשה קטן באופן חריג. כאן אנו מדגימים השתלת עדשה הניסוי כדי לקבוע אם פנוטיפ זה נובע גורם פנימי או אינטראקציות עם רקמות פגומות המקיפים את העדשה.
Abstract
העדשה משחק תפקיד חשוב בהתפתחות של כוס הראייה [1,2]. השימוש דג הזברה כמודל אורגניזם, שאלות לגבי התפתחות העדשה ניתן לטפל. דג הזברה הוא שימושי עבור מחקרים גנטיים בשל יתרון מאפיינים, ובהם גודל קטן, פוריות גבוהה, מחזור חיים קצר, וקלות לטיפול. פיתוח עדשה מתרחשת במהירות דג הזברה. עד hpf 72, העדשה דג הזברה הוא בוגר תפקודית [3]. משאבים גנטיים מולקולריים שופע זמינים כדי לתמוך במחקר דג הזברה. בנוסף, הדמיון של העין דג הזברה לאלה של חוליות אחרים מספק בסיס השימוש בו במודל חיה מעולה של פגמים אנושיים [4-7]. מוטנטים דג הזברה מספר מפגינים ליקויים העדשה, כולל רמות גבוהות של מוות של תאים, אשר בחלק מהמקרים גורמת לניוון מוחלט של רקמות העדשה [8].
כדי לקבוע אם הפרעות העדשה הן בשל גורם פנימי או פגום אינטראקציות עם הרקמות הסובבות, השתלת עדשה לתוך העין מוטציה wild-type מבוצע. באמצעות אש מלוטש מחטים מתכת, עדשות מוטנטי או wild-type הם גזור בקפידה מן החי התורם, והועבר לתוך המארח. כדי להבדיל בין הרקמות wild-type ו - מוטציה, קו מהונדס משמש התורם. קו זה מבטא קרום הנכנס GFP ברקמות, כולל העדשה. טכניקה זו השתלה היא כלי חיוני במחקרים של מוטנטים דג הזברה העדשה.
Protocol
חלק 1: הכנת עוברים
בפרוטוקול זה, נשתמש בסמל JJ xy לציון מוטציה היפותטי העדשה דג הזברה.
- זני דג הזברה נשמרים בתנאים מתקן סטנדרטי דגים ב-C 28.5 על מחזור light/10h 14h כהה.
- בערב, זכרים ונקבות מקום של ג'יי ג'יי זן דג הזברה xy: AB / TU; TG (mGFP) במיכל עם מחיצה כדי להפריד אותם אחד מהשני. הצאצאים של צלב זה יבטא את transgene GFP ברקמות כולם, ישמש תורמים. במקביל, השתמש בפרוצדורה זהה כדי להגדיר חוצה בין הלא מהונדס wild-type בעלי חיים. בהתאם לצורך ניסוי זה, אפשר לחצות את חיות הבר מסוג ב מוקד JJ xy כמו תורמים או המארחים.
- תוך שעה אחת לאחר שהאור נדלק בבוקר, להסיר את המחיצות כדי לאפשר דגים להזדווג.
- לאחר 15-30 דקות לאסוף עוברים 100 x 15 מ"מ צלחות פטרי, לנקות אותם, ולשנות את המדיום (מים ביצה).
- שמור את העוברים 28.5 C החממה עד הזמן הרצוי.
- כאשר מוכן להשתלה, להסיר את סיסית ידני עם שני זוגות מלקחיים חדים, דגירה עוברים EDTA 0.2% ב-ZFR סידן חינם במשך 30 דקות.
חלק 2: הכנת מחטים לנתיחה
- הליך ההשתלה דורשת שני סוגים של מחטים: אחת חידד, המשמש לחתוך הרקמות הסובבות את העדשה, להסיר את סיסית, ועוברים שחרור agarose וכן מחט קהה המשמש כדי להזיז את העדשה התורם להכניס אותו לתוך המחשב המארח. כאן אנו יראה לכם כיצד לעשות את המחטים.
- ראשית, קצה פיפטה פסטר חייבים להיות מנותקים באמצעות סכין יהלום. ואז להוסיף כוס נימי אל קצה פיפטה פסטר כך כמחצית אורכו בתוכו. זה יקל לשתק את החוט טונגסטן על ידי המסת אותו לתוך הכוס בשלב הבא.
- ואז להוסיף תיל טונגסטן דק לתוך סוף הפתוחים של נימי. ממיסים את הכוס על חוט עם מבער בונזן. בעזרת מלקחיים, להחזיק בסוף יציב את הכוס עם חוט המתכת תוך פיתול את הקצה השני של המחט עם היד שלך. הזכוכית מרוככת ספירלה סביב המתכת צריך מרתק אותו במקום.
- אם אתה עושה מחט קצה קהה, אז זה הסוף של ההליך. כדי ליצור מחט חידד, החזק את החוט טונגסטן מעל מבער בונזן עבור 1-1.5 דקות, שורף את המתכת כך טיפ יפה מאוד נוצר. בדוק את איכות טיפ על ידי microscropy.It הוא רעיון טוב לעקר הן מחטים הלהבה לכמה שניות מיד לפני ההשתלה.
חלק 3: הכנת ריאגנטים
- סידן חינם (ZFR) דג הזברה Ringer של פתרונות (116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 5 HEPES מ"מ, pH 7.2)
- 0.2% EDTA בסידן ללא פתרונות דג הזברה של רינגר (pH 7.2)
- 1.2% agarose (נקודת התכה נמוכה) ב-ZFR סידן חינם
- 0.2% agarose (נקודת התכה נמוכה) ב-ZFR סידן חינם
- בינוני עובריים (pH 7.0, לליטר מכיל: 10 מ"ל פתרון הנקס # 1, 1ml פתרון הנקס # 2, פתרון 10ml הנקס # 4, הפתרון 10ml הנקס # 5, 0.35 גרם נתרן ביקרבונט, 300 UL של 2M HCl, פניצילין, סטרפטומיצין 500.000 U) כפי שמתואר בספר דג הזברה (אוניברסיטת אורגון Press, 2000).
- תיל טונגסטן, מצופה זהב, בקוטר של 0.1mm, אלפא Aesar
- צינור נימי, בקוטר של 1.0mm, Precision Instruments העולם
חלק 4: הליך השתלה
- בתוך צינור פלסטיק צנטריפוגות, להכין 1.2% נמוך נקודת התכה agarose ב-ZFR סידן חופשי שחומם מראש ל-C 40 באמבט מים.
- בשלב הרצוי (30 hpf, למשל), לקחת את העוברים פיפטה פסטר, לאט לגרש אותם לתוך הצינור צנטריפוגות, ולאט לאט לגרש אותם לתוך הצינור צנטריפוגות ו דגירה במשך כ 5 שניות. התורמים ומארחים צריך להיות מודגרות בנפרד.
- עם טפטפת, לקחת את העוברים agarose 1.2% מהצינור צנטריפוגות ומסדרים אותם בשתי שורות מקבילות צלחת פטרי 100mm קלקר, שמירה המארחים ותורמים נפרד. עד pipetting אותם לאט ובזהירות, רוב העוברים ישקר על צדם של agarose. יהיה עליך לכוון את אלה שאינם שוכבים בתנוחה זו באמצעות מחט קהה כך העין כלפי מעלה לפני agarose מתמצק.
- המתן agarose 1.2% לחזק ולאחר מכן כיסוי זה עם 0.2% נקודת התכה נמוכה פתרון agarose.
- באמצעות מחט חידד, להסיר כל agarose סביב העיניים, מאוד בזהירות לחתוך את העדשה מן המארח עוברים התורם באמצעות משיכות קטנות. הקפד לחתוך מספיק קרובים העדשה כדי לא לקרוע אותו, אבל גם אז אתה לא להסיר רקמה מדי משאר עין המארח.
- ברגע חופשי, עדשות יצוף במדיום. באמצעות מחט בוטה, בזהירות לדחוף את התורםהעדשה בדיוק מעל המיקום של איפה לארח את העדשה יהיה כרגיל, ולאחר מכן לדחוף אותו לתוך העין עם המחט קהה. העדשה עשויה לארח להיות מושלך.
- השאר עוברים התורם המארח agarose 1.2% עבור 30-60 דקות, ואז לשחרר אותם מן agarose באמצעות מחט חדה, ולהעביר אותם לתוך צלחת של 24 באר עם המדיום העובר. כל העובר צריך לכבוש גם נפרדים. הקפד לתייג את בארות כראוי כך ברור אשר מתאים לארח אשר תורם.
- דגירה ב 28.5 ג התורם הנגזרות העדשה ניתן להבחין בין העדשה מארח בצד unoperated של החיה אותו מבוסס על ה-GFP פלואורסצנטי. מדורים אפשר גם למדוד את גודל העדשה כדי לקבוע אם הוא מבדיל כראוי.
איור. 1 תמונה בהגדלה נמוכה של מחט חידד המשמש השתלת עדשה. זכוכית נימי (ב) מוכנס לתוך פיפטה פסטר (א), וכן חוט דק טונגסטן (C) מוכנס לתוך סוף הפתוחים של נימי. הזכוכית מעל החוט הוא התרכך עם מבער בונזן. בעזרת מלקחיים, להחזיק בסוף יציב את הכוס עם חוט המתכת תוך סובב את הקצה השני של פיפטה פסטר עם היד שלך. הזכוכית מרוככת צריך ספירלה סביב המתכת, לופת אותו במקום.
איור. 2 טיפים של שני סוגים של מחטים המשמשים השתלת עדשה.
איור. 3 עוברים עברה השתלת עדשה ב 30hpf. המוצגים הם עובר התורם (A, B), עין מארח עם עדשה המושתלים (C, D), ואת הצד מלאה של העובר מארח (E, F). כל עין מוצג באור הן מועבר תאורה UV כמצוין. התמונות צולמו ב hpf 48. Q01 [9] קו מהונדס נעשה שימוש בניסוי הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים אחדים דורשים תשומת לב מיוחדת במהלך השתלות העדשה.
- חידד מחטים: עדיף להכין מחטים מספר לפני ביצוע השתלת עדשה, וקצה מחטים צריך להיות דק ככל האפשר. מחט עבה יקרע רקמות יותר בגלל קוטר רחב יותר שלה, גורם לכישלון בעין לרפא.
- סידור עוברי: ממש לפני השתלת אתה חייב למקם את העוברים ולכן הם שוכבים על צדם. כאשר מיקום, agarose 1.2% להקשיח יכול מהר מאוד. כדי להאט את התקשות agarose, צלחת פטרי ניתן שחומם מראש על ידי לתת לה לצוף אמבטיה 40 מעלות צלזיוס המים.
- לפני הכנסת העדשה תורם לתוך העין המארח, מנסה להסיר agarose ככל סביב הראש מארח האפשרי. קל יותר להכניס את העדשה תורם כך.
- רק לאחר השתלת עדשה העוברים יש להשאיר מוטבע בשכבת agarose 1.2% מכוסה בשכבה agarose 0.2%. הוספת בינוני עובר עם אנטיביוטיקה תקדם ריפוי הפצע התורם וגם עוברים המארח. המתן 30-60 דקות לפני שחרור עוברים מן agarose, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך צלחת של 24 באר עם המדיום העובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
הליך זה כדלקמן במידה רבה את טכניקת השתלת שפותחה עבור דג המערה על ידי המעבדה של ביל ג'פרי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
- Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
- Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
- Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
- Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
- Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).
