Summary
Lens ontwikkeling houdt interacties met andere weefsels. Verschillende zebravis oog mutanten worden gekenmerkt door een abnormaal kleine lens formaat. Hier laten we zien een lens transplantatie experiment om te bepalen of dit fenotype is te wijten aan intrinsieke oorzaken of defecte interacties met weefsels die de lens omringen.
Abstract
De lens speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de optische beker [1,2]. Met behulp van de zebravis als model organisme is, kan vragen met betrekking tot de ontwikkeling van objectieven worden aangepakt. De zebravis is handig voor genetische studies te wijten aan verschillende voordelige eigenschappen, met inbegrip van kleine formaat, de hoge vruchtbaarheid, korte levenscyclus, en het gemak van de zorg. Lens ontwikkeling treedt snel in zebravis. Met 72 HPF, de zebravis lens is functioneel volwassen [3]. Overvloedige genetische en moleculaire middelen beschikbaar zijn voor onderzoek in de zebravis te ondersteunen. Daarnaast is de gelijkenis van de zebravis oog met die van andere gewervelde dieren biedt basis voor het gebruik ervan als een uitstekend diermodel van menselijke gebreken [4-7]. Verschillende zebravis mutanten vertonen lens afwijkingen, met inbegrip van hoge niveaus van celdood, wat in sommige gevallen leidt tot een volledige degeneratie van weefsels lens [8].
Om te bepalen of lens afwijkingen te wijten zijn aan intrinsieke oorzaken of aan gebrekkige interactie met de omliggende weefsels, is transplantatie van een mutant lens in een wild-type eye uitgevoerd. Met behulp van brand-gepolijste metalen naalden, mutant of wild-type lenzen worden zorgvuldig ontleed van de donor dier, en overgebracht naar de gastheer. Om onderscheid te maken wild-type en mutant weefsels, is een transgene lijn gebruikt als de donor. Deze lijn drukt membraan-gebonden GFP in alle weefsels, inclusief de lens. Deze transplantatie techniek is een essentieel instrument in de studies van de zebravis lens mutanten.
Protocol
Deel 1: Het voorbereiden van de embryo's
In dit protocol zullen we gebruik maken van de JJ xy symbool om een hypothetische zebravis lens mutant aan te duiden.
- Zebravissen stammen worden onderhouden in standaard vis faciliteit omstandigheden op 28,5 C op een 14h light/10h donker cyclus.
- In de avond plaats mannetjes en vrouwtjes van de zebravis stam jj xy: AB / TU; tg (mGFP) in een tank met een divider om ze te scheiden van elkaar. Het nageslacht van deze kruising zal uiten de GFP transgen in alle weefsels, en zal worden gebruikt als donor. Parallel, gebruikt u dezelfde procedure op te zetten kruisingen tussen niet-transgene wild-type dieren. Afhankelijk van het doel van dit experiment, kan men oversteken dieren, wild-type op de jj xy locus als donor of hosts.
- Binnen een uur na het licht gaat branden in de ochtend, verwijder de verdelers om de vis te laten paren.
- Na 15-30 minuten embryo's te verzamelen in 100 x 15 mm petrischaaltjes, maak ze schoon, en verander het medium (ei water).
- Houd de embryo's in een 28,5 C incubator tot de gewenste tijd.
- Als u klaar bent voor transplantatie, handmatig verwijderen van de chorion met twee paar scherpe tang, en incubeer de embryo's in 0,2% EDTA in calcium-vrije ZFR gedurende 30 minuten.
Deel 2: Bereiding van dissectie naalden
- De transplantatie procedure vereist twee soorten naalden: een verscherpt een, die wordt gebruikt om weefsels rondom de lens snijden, het chorion te verwijderen, en laat embryo's van agarose en een stompe naald wordt gebruikt om de donor lens te verplaatsen en in te voegen in het gastland. Hier zullen we zien hoe je deze naalden te maken.
- Ten eerste moet de punt van een Pasteur pipet worden afgesneden met behulp van een diamant mes. Steek vervolgens een glazen capillaire in de Pasteur pipet tip zo dat ongeveer de helft van zijn lengte erin zit. Dit zal het gemakkelijker maken om de wolfraam draad immobiliseren door het smelten van het in het glas in de volgende stap.
- Steek vervolgens een dun wolfraam draad in het open uiteinde van de capillair. Smelt de glas over de draad met een bunsenbrander. Met behulp van een tang, Hold Steady het glas eindigen met de metalen draad, terwijl het verdraaien van de andere kant van de naald in uw hand. De zachte glas dient spiraal rond de metalen grip op zijn plaats.
- Als u het maken van een stompe punt naald, dan is dit het einde van de procedure. Voor het maken van een scherpe naald, houdt u de wolfraam draad over een Bunsen-brander voor 1 tot 1,5 minuten, het branden van de metalen, zodat een zeer fijne tip is gemaakt. Controleer de kwaliteit van de tip door microscropy.It is een goed idee om beide naalden in de vlam meteen steriliseren voor een paar seconden vóór de transplantatie.
Deel 3: Voorbereiding van de reagentia
- Calcium-vrije zebravis Ringer's (ZFR) Solutions (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7,2)
- 0,2% EDTA in calcium-vrije zebravis Ringer's Solutions (pH 7,2)
- 1,2% agarose (laag smeltpunt) in calcium-vrije ZFR
- 0,2% agarose (laag smeltpunt) in calcium-vrije ZFR
- Embryo medium (pH 7.0, per liter bevat: 10 ml Hanks Oplossing # 1, 1 ml Hanks Oplossing # 2, 10 ml Hanks Oplossing # 4, 10 ml Hanks Oplossing # 5, 0,35 g natriumbicarbonaat, 300 uL van 2M HCl, penicilline-streptomycine 500.000 U) als in de zebravis Boek (University of Oregon Press, 2000).
- Wolfraam draad, verguld, 0,1 mm diameter, Alfa Aesar
- Capillair, 1,0 mm diameter, World precisie-instrumenten
Deel 4: Transplantatie procedure
- In een plastic centrifugebuis, voor te bereiden 1,2% een laag smeltpunt agarose in de calcium-vrije ZFR voorverwarmd tot 40 ° C in een waterbad.
- Op het gewenste moment (30 HPF, bijvoorbeeld), nemen de embryo's in een Pasteur pipet, langzaam te verdrijven in de centrifugebuis, en langzaam te verdrijven in de centrifugebuis en incubeer gedurende ongeveer 5 seconden. De donoren en hosts dienen afzonderlijk te worden geïncubeerd.
- Met een pipet, nemen de embryo's in 1,2% agarose uit de centrifugebuis en schik ze in twee parallelle rijen in een 100 mm polystyreen petrischaal, het houden van hosts en donoren te scheiden. Door pipetteren ze langzaam en voorzichtig, zullen de meeste embryo's liggen op hun zij in de agarose. U moet voor diegenen die niet liggen in deze positie met behulp van de stompe naald, zodat het oog naar boven voordat de agarose stolt heroriënteren.
- Wacht tot de 1,2% agarose te stollen, en dan overlay met 0,2% laag smeltpunt agarose oplossing.
- Met behulp van de geslepen naald, verwijder agarose rond de ogen, en heel voorzichtig knip de lens uit de host en donor embryo's met behulp van kleine beroertes. Zorg ervoor dat u net dicht genoeg gesneden om de lens, zodat er geen scheuren, maar ook zodat u niet te veel weefsel niet verwijderen van de rest van de gastheer oog.
- Eenmaal vrij, zal lenzen drijven in het medium. Met behulp van de stompe naald voorzichtig druk op de donorlens tot net boven de plaats waar de gastheer lens normaal zou zijn, en dan duw hem naar beneden in het oog met de stompe naald. De host lens kan worden weggegooid.
- Laat donor en gastheer embryo's die in 1.2% agarose gedurende 30-60 minuten, laat dan deze uit de agarose het gebruik van de scherpe naald, en breng ze in een 24-wells plaat met embryo medium. Elk embryo moet nemen een aparte goed. Zorg ervoor dat de putten label netjes, zodat duidelijk is welke host overeenkomt met die donor.
- Incubeer bij 28,5 C. De donor-afgeleide lens kan worden onderscheiden van de host lens op de niet geopereerde kant van hetzelfde dier op basis van GFP fluorescentie. Secties kunnen ook worden verwezen naar lens grootte te meten en te bepalen of het goed onderscheidt.
Fig. Een lage vergroting beeld van een scherpe naald gebruikt voor het objectief transplantatie. Een glas capillair (B) wordt ingebracht in de Pasteur pipet (A), en een dun wolfraam draad (C) is ingebracht in het open uiteinde van de capillair. Het glas over de draad wordt verzacht met een bunsenbrander. Met behulp van een tang, Hold Steady het glas eindigen met de metalen draad, terwijl het verdraaien van de andere kant van het Pasteur pipet met uw hand. De zachte glas dient spiraal rond de metaal-, aangrijpend op zijn plaats.
Fig. 2 De uiteinden van de twee soorten naalden worden gebruikt voor de lens transplantatie.
Fig. 3 Embryo's onderging lens transplantatie bij 30hpf. Getoond wordt een donor embryo (A, B), een host in de gaten met een getransplanteerde lens (C, D), en de controle kant van de gastheer embryo (E, F). Elk oog is te zien in zowel doorvallend licht en UV-belichting zoals aangegeven. Foto's werden genomen op 48 hpf. De Q01 [9] transgene lijn werd gebruikt in dit experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meerdere stappen vereisen speciale aandacht tijdens de lens transplantaties.
- Geslepen naalden: Het is beter om een aantal naalden voor te bereiden op het uitvoeren van lens transplantatie, en het topje van de naalden moet zo dun mogelijk. Een dikkere naald zal scheuren meer weefsel vanwege zijn grotere diameter, waardoor een storing in het oog om te genezen.
- Het regelen van de embryo's: Vlak voor de transplantatie, moet u de positie van de embryo's zodat ze op hun zij liggen. Bij het positioneren, de 1,2% agarose kunnen zeer snel uitharden. Om langzaam de verharding van agarose, kan de petrischaal worden voorverwarmd door te laten drijven in een 40 ° C waterbad.
- Voordat u de lens donor in de gastheer oog, proberen om zo veel agarose te verwijderen om de host hoofd mogelijk te maken. Het is makkelijker om in te voegen de donor lens op die manier.
- Net na de transplantatie lens van de embryo's moet worden overgelaten ingebed in de 1,2% agarose laag gedekt door een 0,2% agarose laag. Het toevoegen van embryo medium met antibiotica zal bevorderen wondgenezing in zowel donor en gastheer embryo's. Wacht 30-60 minuten voor het vrijgeven van embryo's uit agarose, en breng ze in een 24-wells plaat met embryo medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze procedure volgt voor een groot deel van de transplantatie techniek voor grot vis is ontwikkeld door het lab van Bill Jeffrey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev Biol. 231, 63-76 (2001).
- Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. Central role for the lens in cave fish eye degeneration. Science. 289, 631-633 (2000).
- Easter, S. S., Nicola, G. N. The development of vision in the zebrafish(Danio rerio). Dev Biol. 180, 646-663 (1996).
- Schmitt, E., Dowling, J. Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio. J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).
- Malicki, J. Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina. Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).
- Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish. Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).
- Avanesov, A., Malicki, J. Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina. Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects. Vision Res. 42, 535-540 (2002).
- Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).
