Summary
Objectif de développement implique des interactions avec d'autres tissus. Plusieurs mutants oeil de poisson zèbre sont caractérisés par une taille anormalement petite lentille. Ici nous démontrons une expérience de transplantation objectif pour déterminer si ce phénotype est dû à des causes intrinsèques ou des interactions défectueuses avec les tissus qui entourent la lentille.
Abstract
L'objectif joue un rôle important dans le développement de la cupule optique [1,2]. En utilisant le poisson zèbre comme organisme modèle, les questions concernant le développement lentille peut être adressée. Le poisson zèbre est utile pour des études génétiques en raison de plusieurs caractéristiques avantageuses, y compris de petite taille, taux de fécondité élevé, cycle de vie court, et la facilité d'entretien. Objectif de développement se produit rapidement chez le poisson zèbre. Par 72 HPF, la lentille de poisson zèbre est fonctionnellement matures [3]. L'abondance des ressources génétiques et moléculaires sont disponibles pour soutenir la recherche dans le poisson zèbre. En outre, la similitude de l'œil de poisson zèbre à ceux des autres vertébrés fournit une base pour son utilisation comme un modèle animal d'excellents défauts de l'homme [4-7]. Plusieurs mutants poisson zèbre présentent des anomalies lentilles, y compris des niveaux élevés de mort cellulaire, ce qui dans certains cas, conduit à une dégénérescence complète des tissus lentille [8].
Afin de déterminer si des anomalies de lentilles sont dus à des causes intrinsèques ou à défaut les interactions avec les tissus environnants, la transplantation d'une lentille mutant dans un oeil de type sauvage est effectuée. L'utilisation d'aiguilles métalliques polies au feu, les lentilles de mutant ou de type sauvage sont soigneusement disséquées de l'animal donneur, et transférés dans l'hôte. Afin de distinguer les tissus de type sauvage et mutant, une lignée transgénique est utilisé comme donneur. Cette ligne exprime membranaires GFP dans tous les tissus, y compris l'objectif. Cette technique de transplantation est un outil essentiel dans les études de mutants lentilles poisson zèbre.
Protocol
Partie 1: Préparation des embryons
Dans ce protocole, nous allons utiliser le symbole JJ xy pour désigner un mutant de poisson zèbre hypothétique objectif.
- Zebrafish souches sont maintenus dans des conditions standard de facilité de poissons à 28,5 C sur un cycle de 14h light/10h sombre.
- Dans la soirée, les mâles et les femelles lieu du poisson-zèbre souche JJ xy: AB / TU; tg (mGFP) dans un réservoir avec un diviseur de les séparer les uns des autres. La descendance de ce croisement exprimeront le transgène GFP dans tous les tissus, et seront utilisés comme donneurs. En parallèle, utilisez la même procédure pour mettre en place des croisements entre non transgéniques animaux de type sauvage. Selon le but de cette expérience, on peut traverser les animaux de type sauvage au locus JJ xy en tant que donneurs ou hôtes.
- Dans une heure après la lumière s'allume dans la matinée, retirer les séparateurs pour permettre aux poissons de se reproduire.
- Après 15-30 minutes de recueillir des embryons dans 100 x 15 mm boîte de Pétri, les nettoyer et changer le milieu (eau oeuf).
- Gardez les embryons dans un incubateur à 28,5 C jusqu'au moment désiré.
- Lorsque vous êtes prêt pour la transplantation, retirez le chorion manuellement avec deux paires de forceps pointu, et incuber les embryons dans 0,2% d'EDTA en calcium sans ZFR pendant 30 minutes.
Partie 2: Préparation des aiguilles de dissection
- La procédure de transplantation nécessite deux types d'aiguilles: une aiguisée, qui est utilisé pour couper les tissus entourant la lentille, retirer le chorion, et les embryons libération de agarose et une aiguille émoussée utilisée pour déplacer la lentille donateurs et l'insérer dans l'hôte. Ici, nous allons vous montrer comment faire de ces aiguilles.
- Tout d'abord, la pointe d'une pipette Pasteur doit être coupé avec un couteau de diamant. Ensuite, insérez un verre capillaire dans la pointe pipette Pasteur de sorte qu'environ la moitié de sa longueur est à l'intérieur. Ce sera plus facile pour immobiliser le fil de tungstène par fusion dans le verre à l'étape suivante.
- Ensuite, insérez un fil de tungstène minces dans l'extrémité ouverte du capillaire. Faire fondre le verre sur le fil avec un bec Bunsen. En utilisant des pinces, rester stable à la fin de verre avec le fil métallique tout en tordant l'autre extrémité de l'aiguille à la main. Le verre ramolli devrait spirale autour du métal, il préhension en place.
- Si vous effectuez une aiguille pointe arrondie, alors c'est la fin de la procédure. Pour créer une aiguille aiguisée, tenir le fil de tungstène sur un bec Bunsen pendant 1-1,5 minutes, brûler le métal donc une pointe très fine est créé. Vérifier la qualité de pointe par microscropy.It est une bonne idée de stériliser les deux aiguilles dans la flamme pendant quelques secondes immédiatement avant la transplantation.
Partie 3: Préparation des réactifs
- Sans calcium Zebrafish Ringer (ZFR) Solutions (116 mM NaCl, 2,9 mM de KCl, 5 mM d'HEPES, pH 7,2)
- 0,2% en calcium des solutions sans Zebrafish Ringer (pH 7,2) EDTA
- 1,2% (point de fusion bas) agarose en calcium sans ZFR
- 0,2% (point de fusion bas) agarose en calcium sans ZFR
- Embryon moyenne (pH 7,0, contenant par litre: 10 ml Hanks Solution # 1, 1 ml de solution de Hanks n ° 2, 10ml Hanks Solution n ° 4, 10ml Hanks Solution # 5, le bicarbonate de sodium 0,35 g, 300 uL d'HCl 2M, la pénicilline-streptomycine 500 000 U) comme dans le livre de poisson zèbre (Université de l'Oregon Press, 2000).
- Fils de tungstène, plaqué or, diamètre 0.1mm, Alfa Aesar
- Capillaire, diamètre 1.0mm, Instruments de précision du monde
Partie 4: procédure de transplantation
- Dans un tube à centrifuger en plastique, préparez 1,2% d'agarose bas point de fusion en calcium sans ZFR préchauffé à 40 ° C dans un bain d'eau.
- Au stade désiré (30 HPF, par exemple), prennent les embryons dans une pipette Pasteur, lentement les expulser dans le tube de centrifugation, et lentement les expulser dans le tube de centrifugeuse et incuber pendant environ 5 secondes. Les donateurs et les hôtes doivent être incubés séparément.
- Avec une pipette, prendre jusqu'à les embryons dans agarose à 1,2% du tube de centrifugeuse et les organiser en deux rangées parallèles dans une boîte de Pétri en polystyrène de 100mm, en gardant les hôtes et les donateurs séparée. En les pipetage lentement et prudemment, la plupart des embryons seront couchés sur le flanc dans l'agarose. Vous aurez besoin de réorienter ceux qui ne réside pas dans cette position en utilisant l'aiguille émoussée de telle sorte que l'œil est orienté vers le haut avant que l'agarose se solidifie.
- Attendez que l'agarose à 1,2% à solidifier, puis superposer avec 0,2% de point de fusion solution à faible agarose.
- Utilisation de l'aiguille aiguisé, enlever tout d'agarose autour des yeux, et très soigneusement coupés de la lentille à partir de l'hôte et les embryons donneurs à l'aide de petites touches. Assurez-vous de couper juste assez proche de l'objectif afin de ne pas le déchirer, mais aussi afin que vous ne retirez pas trop de tissu par rapport au reste de l'œil hôte.
- Une fois libre, lentilles flottent dans le milieu. Utilisation de l'aiguille émoussée, poussez délicatement le donateurlentilles juste au-dessus de l'emplacement de l'endroit où la lentille de l'hôte serait normalement, puis enfoncez-la dans les yeux avec l'aiguille émoussée. La lentille de l'hôte peut être écarté.
- Laisser embryons donateurs et d'accueil en agarose à 1,2% pour les 30-60 minutes, puis les libérer de l'agarose en utilisant l'aiguille forte, et les transférer dans une plaque de 24 puits avec un milieu de l'embryon. Chaque embryon doit occuper un autre puits. Assurez-vous de l'étiquette du puits proprement qu'il est clair, qui correspond à l'hôte qui donateur.
- Incuber à 28,5 C. L'provenant de donneurs lentille peut être distinguée de la lentille de l'hôte sur le côté non opéré du même animal repose sur fluorescence de la GFP. Les articles peuvent également être faites pour mesurer la taille d'objectif et de déterminer si elle différencie correctement.
Fig. 1 image à faible grossissement d'une aiguille aiguisée utilisée pour objectif de transplantation. Un capillaire en verre (B) est insérée dans la pipette Pasteur (A), et un mince fil de tungstène (C) est insérée dans l'extrémité ouverte du capillaire. Le verre sur le fil est adoucie par un bec Bunsen. En utilisant des pinces, rester stable à la fin de verre avec le fil métallique tout en tordant l'autre extrémité de la pipette Pasteur avec votre main. Le verre ramolli devrait spirale autour du métal, le saisissant à la place.
Fig. 2 Les conseils des deux types d'aiguilles utilisées pour objectif de transplantation.
Fig. 3 embryons ont subi lentille de la transplantation au 30hpf. On voit ici un embryon donneur (A, B), un œil sur l'hôte avec un objectif de transplanter (C, D), et le côté le contrôle de l'embryon hôte (E, F). Chaque œil est montré à la fois dans la lumière transmise et éclairage UV tel qu'indiqué. Les photographies ont été prises à 48 HPF. Le Q01 [9] transgéniques ligne a été utilisée dans cette expérience.
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Discussion
Plusieurs étapes nécessitent une attention particulière lors de transplantations d'objectif.
- Aiguisé aiguilles: Il est préférable de préparer plusieurs aiguilles avant d'effectuer la transplantation lentilles, et la pointe de l'aiguille doit être aussi mince que possible. Une aiguille plus épaisse va déchirer plus de tissu en raison de son plus grand diamètre, provoquant une panne dans les yeux pour guérir.
- Organiser les embryons: Juste avant la transplantation, vous devez positionner les embryons de sorte qu'ils sont couchés sur leurs côtés. Lors du positionnement, l'agarose à 1,2% peut durcir très rapidement. Pour ralentir le durcissement de l'agarose, la boîte de Petri peut être préchauffé en le laissant flotter dans un bain d'eau à 40 ° C.
- Avant d'insérer l'objectif des bailleurs de fonds dans l'œil d'hôte, essayez d'enlever autant d'agarose autour de la tête d'hôte possible. Il est plus facile d'insérer l'objectif des bailleurs de fonds de cette façon.
- Juste après la transplantation des embryons lentille doit être laissé embarqué dans la couche de 1,2% d'agarose recouvertes par une couche d'agarose 0,2%. Ajout moyennes embryon avec des antibiotiques favorisera la cicatrisation des plaies dans les pays donateurs et d'embryons hôte. Attendre 30-60 minutes avant de libérer des embryons à partir d'agarose, puis les transférer dans une plaque de 24 puits avec un milieu de l'embryon.
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Acknowledgments
Cette procédure suit dans une large mesure de la technique de transplantation développés pour les poissons grotte par le laboratoire de Bill Jeffrey.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1mm diameter tungsten wire | A Johnson Matthey | 45086 | |
| Agarose(low melting point) | Sigma-Aldrich | 39346 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW 100-4 | |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | |
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette pump | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Petri Dish | Cardinal Health | D1906 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 |
References
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